超薄切片電鏡在肉瘤樣腎細胞癌病理活檢中的應用

武良美，王 璇，程 凱，馬恒輝，陸珍鳳，饒 秋，陳 輝

超薄切片電鏡是生物透射電鏡樣品制備中最經典、最基礎的實驗技術方法，該技術在活檢病理診斷特別是慢性腎臟疾病和肝臟代謝性疾病診斷中應用廣泛[1]。隨著免疫組化和分子病理技術的發展，其在腫瘤病理診斷中的應用已逐漸被邊緣化。盡管如此，該方法在細胞凋亡、超微結構病理觀察以及腫瘤鑒別診斷方面的研究仍具有廣闊的應用前景。肉瘤樣腎細胞癌(sarcomatoid renal cell carcinoma, sRCC)是指腎癌細胞發生肉瘤樣分化的一種特殊病理學改變，可發生于所有腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)亞型中[2]。其發生率為1.6%～5.1%，具有典型的腫瘤內異質性，易復發和轉移，預后差[3]。目前，尚未有針對sRCC內超微結構特征觀察的研究報道。因此，本實驗采用超薄切片電鏡技術對sRCC活檢病理診斷進行觀察，總結不同sRCC亞型腫瘤細胞內超微結構的特征，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年1～10月中國人民解放軍東部戰區總醫院存檔的2例術中冷凍病理診斷為sRCC的標本，患者均為男性，年齡47、76歲。根據WHO/ISUP(2016)泌尿系統腫瘤分類、分級標準，1例診斷為透明細胞腎細胞癌伴肉瘤樣分化(clear cell renal cell carcinoma with sarcomatoid differentiation, sccRCC)，另1例診斷為嫌色細胞腎細胞癌伴肉瘤樣分化(chromophobe renal cell carcinoma with sarcomatoid differentiation, scRCC)，均為WHO/ISUP 4級。

1.2 方法

1.2.1冷凍切片HE染色 腫瘤新鮮組織均采用OCT包埋、Leica CM1950冷凍切片機6 μm厚連續切片、75%乙醇固定的常規術中冷凍方式進行操作，用于HE染色。

1.2.2電鏡超薄切片 根據術中冷凍切片HE染色結果對新鮮組織塊進行如下操作：(1)取材：分別取sccRCC及scRCC肉瘤樣變區新鮮組織塊，小于1 mm3。(2)固定：2.5%戊二醛1～2 h，PBS洗15 min×3次；1%餓酸2～3 h，PBS洗15 min×3次。(3)脫水：組織塊依次經50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇與90%丙酮(1 ∶1)、90%丙酮及100%丙酮室溫各15～20 min。(4)包埋：純丙酮+包埋液(2 ∶1)室溫3～4 h，純丙酮+包埋液(1 ∶2)室溫過夜，純包埋液37 ℃ 2～3 h。(5)固化：37 ℃烤箱過夜，45 ℃烤箱內12 h，60 ℃烤箱24 h。(6)切片：超薄切片機切片，厚約70 nm。(7)染色：3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。(8)JEM-1011透射電鏡觀察，拍片。

2 結果

2.1 光鏡觀察sccRCC細胞呈圓形或多邊形，體積較大，胞膜清楚，呈透明狀，胞質豐富淡染，少量紅染，核呈粗顆粒狀，略呈空泡狀，核分裂象多見，可見少量透明細胞，周圍被大小不一的薄壁血管構成網狀間隔。局部伴沙礫樣鈣化及間質玻璃樣變，鈣化組織中見少量肉瘤樣梭形細胞(圖1)。scRCC細胞呈粉紅色顆粒狀細胞質，胞質嗜酸、核仁明顯、密集且大小不一，部分瘤細胞圓形或不規則形，局部含大量梭形細胞，呈束狀、編織狀排列，偶見淋巴細胞、嗜酸性粒細胞及漿細胞浸潤(圖2)。

①②③④

2.2 電鏡觀察sccRCC細胞內可見脂滴，線粒體少見，并且糖原含量相對較少，未見細胞之間的緊密連接(橋粒)，腫瘤細胞和間質內可見基膜樣物，少數還包裹類似吞噬小體(溶酶體)色深均質物，微囊泡少見(圖3)。scRCC細胞內未發現脂滴，伴有多個腫脹線粒體，并且糖原相對豐富，細胞之間可見大小不等的緊密連接，部分有刷狀微絨毛內襯的腔隙，絕大多數細胞胞質內有數量不等的微囊泡(圖4)。

3 討論

病理醫師主要在光鏡下進行腫瘤診斷，并輔以免疫組化等技術，但有些疾病或分化較差腫瘤的診斷及鑒別診斷必須依賴電鏡甚至是超薄切片電鏡[4]。超薄切片電鏡的分辨率可達80萬倍以上(0.3～0.4 nm)，能夠觀察到組織內各細胞器的內部結構以及細胞之間的連接類型，因此其在腫瘤的鑒別診斷中具有較大的優勢。

由于sRCC組織學結構類似橫紋肌肉瘤，免疫組化同時表達上皮和間葉組織抗原的雙向標記，在光鏡下對sRCC亞型進行分類較難[5-6]。因此，本實驗首次采用超薄切片電鏡進行觀察，sccRCC與scRCC在糖原、脂肪生成、線粒體、微絨毛、微囊泡等超微結構方面差異明顯，說明確實存在特殊的肉瘤樣變的腫瘤微環境和腫瘤內異質性[7-8]，這就使現有的大規模研究數據(包括RNA、全外顯子、單細胞測序等)與組織學表型的聯系越來越復雜化[9-10]。作者猜測這些復雜的機制可能與腫瘤的異常代謝機制相關。由于sRCC發生率較低，其各亞型間也具有差異[3]，導致新鮮病例的收集率較低，今后在實際工作中要多與臨床醫師溝通、合作，為接下來更深入探索RCC細胞發生高級別(肉瘤樣)轉變代謝機制方面的研究準備好充足的臨床資源。

總之，作為一種在超微結構水平的定位技術手段，超薄切片電鏡下觀察sRCC結構完整，細胞內基質結構清晰，為腫瘤細胞形態學的基礎研究及臨床診斷提供有價值的證據。近年來，隨著電鏡光學技術的不斷發展和完善，再結合免疫組化、分子病理技術等，其將在腫瘤臨床及科研工作中具有更廣泛的應用前景，發揮其更大的作用。