USP6基因重排檢測在骨與軟組織病理診斷中的作用

吳春鋒，朱維健，徐 毅，沙曉筱，夏春燕

泛素特異性蛋白酶6(ubiquitin-specific protease6, USP6)又稱TRE17或Tre2，是泛素特異性蛋白酶家族中被最早發現的成員之一。Oliveira等[1]發現在原發性動脈瘤樣骨囊腫(aneurysmal bone cyst, ABC)中存在CDH11-USP6基因重排，提示USP6基因可能具有潛在的致病性。多項研究發現在原發性ABC、結節性筋膜炎(nodular fasciitis, NF)、骨化性肌炎(myositis ossificans, MO)等疾病中存在USP6基因與多種基因發生重排現象。USP6基因重排在原發性ABC、NF等軟組織病變的診斷中具有較好的特異性，能與其他組織學相似的病變進行鑒別[2]。本文回顧性分析42例骨和軟組織病變標本，采用FISH法檢測USP6基因重排情況，了解其在原發性和繼發性ABC、MO及NF等病變中的診斷及鑒別診斷作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2020年12月海軍軍醫大學第二附屬醫院骨科送檢的骨和軟組織標本42例，其中男性22例，女性20例。年齡3～55歲，平均26歲。脊柱病變28例，脛骨病變3例，股骨病變2例，髂骨2例，肱骨1例，髕骨1例，上頜竇1例，右頰1例，手指1例，足趾1例，肩胛1例。1例為穿刺活檢標本，41例為手術刮除或切除標本。所有病例均經兩位經驗豐富的病理學專家重新閱片，按照WHO(2020)骨與軟組織腫瘤分類標準進行病理診斷，并進行USP6基因重排檢測。

1.2 影像學特征原發性和繼發性ABC呈膨脹性溶骨性生長，由充滿血液的腔隙組成，血池間有包含骨小梁的纖維組織間隔。其MRI圖像改變包括多個大小不等的囊狀骨破壞，受累骨呈分葉狀膨脹變形，常向軟組織膨出，邊界為殼狀的骨膜骨或無鈣化的骨膜，其囊腔內含新鮮或陳舊的血液，常常表現為液液平面。

1.3 標本處理送檢組織經10%中性福爾馬林固定、徠卡ASP300脫水機脫水浸蠟、常規石蠟包埋、切片。質硬骨組織樣本經10%甲酸脫鈣液脫鈣軟化處理。

1.4 免疫組化3～5 μm厚的組織防脫切片行免疫組化MaxVision法染色，H3F3A抗組蛋白H3.3 G34W兔單克隆抗體(克隆號RM263)，H3F3B抗組蛋白H3.3 K36M兔單克隆抗體(克隆號RM193)和羊抗兔鼠通用型二抗試劑盒均購自福州邁新生物公司，陽性均為細胞核著色。

1.5 FISH檢測及結果判讀USP6基因雙色分離探針試劑盒購自廣州安必平醫藥公司。探針位于染色體17p13.2，基因近端(近著絲粒)探針標記紅色熒光，基因遠端(近端粒)探針標記綠色熒光。

FISH檢測嚴格按照標準化流程操作，具體步驟：3～5 μm厚的組織防脫切片(65±5) ℃烤片2 h，脫蠟、水化，(100±5) ℃去離子水煮片20 min，胃蛋白酶消化15 min，滴加探針，雜交儀中85 ℃變性5 min，37 ℃雜交10～18 h。4’，6-二脒基-2’-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2’-phenylindole，DAPI)進行核復染，熒光顯微鏡下觀察。

結果判讀：FISH結果由兩位有經驗的病理醫師獨立判讀：計數200個不重疊的細胞核，紅色信號和綠色信號距離>2個信號點為陽性細胞，陽性細胞比例>5%視為分離重排陽性。

1.6 Sanger測序使用PCR儀擴增H3F3A和H3F3B 2號外顯子目的片段，引物由廈門艾德醫學檢驗所合成提供。目的片段擴增反應體系為反應液12.5 μL(dNTPs、Mg2+、Taq酶)，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL，總反應體系25 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，合計40個循環，72 ℃延伸5 min。擴增產物交由廈門艾德醫學檢驗所測序部進行測序，測序結果與基因組DNA序列進行對比，參考序列分別為NM_002107.6和NM_005324.5。

2 結果

經FISH檢測，42例中40例見可判讀的熒光信號；2例檢測不成功，鏡下無熒光信號，均為經酸脫鈣處理。21例USP6基因斷裂重排陽性(1A)，結合病理特征及影像學表現，18例確診為原發性ABC(圖1B)，其中4例為實性ABC(圖1C)、2例NF、1例MO。19例USP6基因斷裂重排陰性(圖2A)，結合影像學表現、病理特征、免疫表型及基因測序結果，其中8例診斷為原發性ABC，7例診斷為繼發性ABC，包括軟骨母細胞瘤(chondroblastoma, CB)2例(圖2B)，骨巨細胞瘤(giant cell tumour of bone, GCT)1例(圖2C)，骨肉瘤1例，纖維結構不良1例，骨化性纖維瘤1例，慢性炎癥1例；另外非ABC樣改變的富于巨細胞的腫瘤4例，分別為骨囊腫2例，腱鞘巨細胞瘤1例，無明確診斷1例。2例FISH檢測失敗，最終診斷1例為纖維結構不良繼發ABC，另1例結合病理特征及影像學表現，最終診斷為原發性ABC。

①A①B①C②A②B②C

本實驗成功檢測到18例原發性ABC、1例MO、2例NF存在USP6基因重排。FISH法檢測USP6基因重排診斷原發性ABC的敏感性為69.2%(18/26)，特異性為100%(18/18)，準確率為75.8%(25/33)(表1)。

表1 40例骨和軟組織病變標本中USP6基因重排情況

3 討論

本實驗探討FISH檢測USP6基因重排在骨和軟組織病變(ABC、MO、NF等)病理診斷中的作用。本組病例檢測到USP6基因重排的軟組織病變包括原發性ABC、NF及MO。其中原發性ABC全部發生于骨，以脊柱最多見(81.4%)，脊柱病變中又以頸椎病變最多見(42.8%)，這些病例基本為我院骨腫瘤科送檢的手術標本，可能與收治的患者以脊柱腫瘤多見有關。2例NF及1例MO具有典型的組織學特征，因發生部位較特殊，行USP6基因重排檢測以輔助診斷，結果均為陽性。文獻報道USP6基因重排還見于指趾纖維骨性假瘤[3]、顱骨筋膜炎[4]、富細胞腱鞘纖維瘤[5]等疾病。

利用FISH法對USP6基因重排進行檢測，在骨和軟組織腫瘤的病理診斷中具有廣泛的運用前景，具有快速、準確且易于開展的優點，對診斷工作幫助較大。但在檢測過程中也存在一些需要注意的問題。首先是樣本的前處理，尤其是骨腫瘤標本，含骨質豐富，質地堅硬，需脫鈣處理。普通強酸脫鈣液因破壞蛋白質及核酸，影響免疫組化和基因檢測，目前已不適用于骨病變的病理診斷。本組42例中2例檢測不成功，鏡下均未見任何有效熒光信號，可能與標本經酸脫鈣軟化處理時間過長有關。EDTA脫鈣液和甲酸性質溫和，對組織內的核酸和抗原損傷小[6-7]，目前已成為我科常規使用的脫鈣液。EDTA脫鈣液脫鈣效果雖然更為理想，但脫鈣時間長，最好同時配合使用超聲脫鈣儀，可以縮短脫鈣周期。其次，在FISH制片過程中，雜交前煮片預處理與胃蛋白酶消化時間及程度是最關鍵的兩個環節，雜交前煮片預處理可采用去離子水高溫水煮法和EDTA修復液高溫水煮法。經對比分析，對富含骨基質的切片，采用前者處理的組織細胞核輪廓完整、熒光信號強度適中且紅綠信號對比度合適，背景干凈，易計數。此外，合理控制胃蛋白酶的消化時間也很重要，本組骨和軟組織標本是先進行了較短時間的消化處理，終止消化后，使用DAPI對核進行復染，觀察細胞核的消化程度，如消化不足，可再用胃蛋白酶進行二次消化，直至得到較好的消化結果即為理想的胃蛋白酶消化時間。參考文獻報道標準[8]，當鏡下觀察到DAPI復染后的核呈現細胞核完整，邊緣完整略呈鋸齒狀、網格狀時即為最優的消化結果。計數判讀時，可先鏡下觀察HE染色形態(FISH檢測應連續切3張組織切片，分別用于HE染色，FISH制片及備用)，圈出病變區域，再行FISH觀察，需注意不管是原發性ABC或是繼發性ABC，組織標本中成分復雜，富含炎癥細胞和多核巨細胞，此類細胞幾乎不出現USP6基因重排，應當不予計數。當陽性比值臨近Cut-off值時，可以重新觀察HE染色形態，重新換區域計數或采用雙熒光信號通道選擇紅綠信號分離較多的區域進行計數，再觀察HE染色形態確定所計數的區域是否為病變區域。當出現紅綠信號分離間距小而又與內對照細胞紅綠間距的狀態存在差異時，可以選擇相應的RT-PCR或二代測序等方法進行驗證，如二代測序法驗證出現新的USP6基因融合點位，也可設計新的FISH法融合探針予以反向驗證檢測，這既可以提高檢測的敏感性，也可以確保結果的準確性。由于每個實驗室的條件不同，發生重排的陰性閾值也不盡相同，我科選擇適當的陰性病例做預實驗，確定本實驗室的陰性閾值。此外，需要至少兩位分子學病理醫師進行判讀以減少判讀誤差。

USP6基因重排檢測在骨與軟組織富于巨細胞的病變及軟組織低級別梭形細胞腫瘤的鑒別診斷中具有重要作用。巨細胞病變，如經典型原發性ABC與良性或惡性骨腫瘤繼發的ABC及骨囊腫易混淆，而實體型ABC則與骨巨細胞瘤、軟骨母細胞瘤、巨細胞修復性肉芽腫、棕色瘤、腱鞘巨細胞瘤等均存在形態學的重疊，導致鑒別診斷困難。近年來，隨著骨腫瘤一些特異性標志物的出現及使用，Rehkamper等[9]提出4步法對這類腫瘤進行鑒別診斷，首先是根據影像學和形態學進行初步診斷，然后結合免疫組化法標記H3.3.G34W、H3.3.K36M的結果，陰性病例繼續行FISH檢測USP6基因重排情況，以上檢測結果全部陰性的病例進行相應基因的測序。例如本組有1例形態學不典型、免疫組化及FISH結果均陰性的富于巨細胞的骨腫瘤，H3F3A和H3F3B測序也均陰性，最終結合影像學表現及病理特征后歸入USP6陰性的原發性ABC。此外，另有2例免疫組化標記分別為H3.3.G34W、H3.3.K36M灶性陽性，FISH法檢測USP6基因重排陽性，而H3F3A和H3F3B測序均陰性，最終診斷為原發性ABC，此2例說明當H3.3.G34W和H3.3.K36M免疫組化標記非彌漫陽性或可疑時，FISH法檢測USP6基因重排具有必要性。Oliveira等[10]研究結果顯示原發性ABC UPS6基因重排發生率為69%，本組為69.2%，結果與之一致，該報道還發現部分原發性ABC存在非USP6基因融合的其他基因融合類型。此外，存在部分H3F3A突變陰性的巨細胞瘤[11]。因此，如何更加精確地對富于巨細胞的骨和軟組織腫瘤進行鑒別診斷，還有待深入探究。

在骨和軟組織腫瘤中越來越多特異性基因突變被發現，提高了對疾病本質的認識，為精準診斷提供了更客觀的指標。這些突變基因也可能是今后腫瘤靶向治療的靶標。本組病例采用FISH法進行UPS6基因重排檢測，在骨和軟組織病變的診斷中具有較高價值，但也會出現結果的假陰性與假陽性，因此在骨和軟組織病變的診斷中需要綜合臨床特征、影像學表現及病理特征。UPS6基因重排在骨和軟組織病變的發生和發展中的作用也有待深入分析。