肺腺癌中KISS1、E-cadherin和vimentin蛋白的表達及臨床意義

婁 寧，潘洪濤，王新立，蔡仁萍，楊 帆

肺癌是發病率、病死率較高的惡性腫瘤，肺腺癌是肺癌最常見的類型。早發現、早診斷能顯著改善患者的預后，手術切除是治療肺腺癌的主要方法[1]。目前，由于缺乏有效的檢測方法，只有少數患者能夠在早期得到治療，而大多數患者就診時腫瘤已進展為中晚期，已發生周圍組織浸潤、淋巴結轉移等，5年生存率不足20%[2-3]。因此，探討肺腺癌浸潤、轉移的分子機制、尋找新的治療靶點，已成為亟需解決的問題。KISS1缺失或表達下調促進腫瘤的形成、發生及發展，EMT起關鍵性作用，但兩者在肺腺癌中的關系研究鮮有報道。因此，本文著重探討肺腺癌中KISS1的表達及與EMT相關分子標志物(E-cadherin和vimentin)的關系，為臨床與病理醫師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2017年12月濟南市第八人民醫院及山東第一醫科大學第二附屬醫院病理科存檔的103例肺腺癌及對應的癌旁組織(距離腫瘤邊緣>3 cm)，標本均經病理學明確診斷?；颊吣挲g37～79歲，平均61.8歲；男性60例，女性43例，其中>60歲者67例，≤60歲者36例。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期43例，Ⅲ+Ⅳ期60例。納入標準：患者行肺葉切除術，病理診斷為肺腺癌；臨床資料完整，可追蹤隨訪；術前均未行放、化療或免疫治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；有嚴重肝、腎等重要臟器功能損害或其他嚴重基礎病者。

1.2 方法手術標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，常規HE染色，免疫組化采用SP法。兔抗人KISS1、vimentin、E-cadherin多克隆抗體、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋公司。切片經65 ℃烤2.5 h，脫蠟水化，微波爐內枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.5)沸騰后，經抗原修復10 min，室溫下冷卻。3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，山羊血清封閉非特異性位點，加入KISS1、E-cadherin、vimentin，4 ℃恒溫過夜。PBS溶液代替一抗作為陰性對照。次日洗滌后加入二抗、辣根酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木精復染、脫水、透明、封固。

1.3 判讀標準染色結果由兩位病理科醫師采用雙盲法閱片，采用半定量法并結合染色強度和染色范圍進行判斷。KISS1、vimentin以腫瘤細胞胞質呈棕黃色為陽性；E-cadherin以腫瘤細胞胞膜呈棕黃色為陽性。光鏡下隨機選取5個高倍鏡視野進行觀察：(1)根據陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據陽性細胞百分數計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將上述兩項得分結果相乘：0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.4 隨訪采用電話進行隨訪，截至2020年12月31日，隨訪時間3～36個月，失訪者的隨訪時間按截尾數據處理。

1.5 統計學分析使用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析，計數資料以相對數指標(%)表示，采用χ2檢驗；相關性分析采用χ2檢驗及Spearman等級相關分析；應用Kaplan-Meier法計算生存率，組間生存曲線的比較采用Log-rank檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌中KISS1及E-cadherin、vimentin的表達103例肺腺癌組織中KISS1定位于腫瘤細胞質，KISS1陽性50例(48.5%)(圖1A、B)，陰性53例(51.5%)；癌旁正常組織中陽性93例(90.3%)，陰性10例(9.7%)，KISS1在肺腺癌癌組織及癌旁組織中的表達差異有統計學意義(P<0.05)。103例肺腺癌組織中E-cadherin染色定位于細胞膜，陽性46例(44.7%)(圖1C、D)，陰性57例(55.3%)；vimentin染色定位于細胞質，陽性55例(53.4%)(圖1E、F)，陰性48例(46.7%)。

圖1 肺腺癌中各蛋白的表達：A.肺腺癌中KISS1呈弱陽性；B.肺腺癌中KISS1呈強陽性；C.肺腺癌中E-cadherin呈弱陽性；D.肺腺癌中E-cadherin呈強陽性；E.肺腺癌中vimentin呈弱陽性；F.肺腺癌中vimentin呈強陽性，SP法

2.2 肺腺癌中KISS1、E-cadherin、vimentin表達與臨床病理特征的關系肺腺癌組織中，KISS1、E-cadherin在腫瘤低分化、Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結轉移組中的表達顯著低于腫瘤高中分化、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(P<0.05)；而vimentin在腫瘤低分化、Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結轉移組中的表達顯著高于腫瘤高中分化、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(P<0.05)。KISS1、E-cadherin、vimentin與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、組織類型均無關(P>0.05，表1)。

表1 肺腺癌中KISS1、E-cadherin、vimentin表達與臨床病理特征的關系

2.3 KISS1表達與E-cadherin、vimentin表達的相關性采用Spearman等級相關分析103例肺腺癌組織中KISS1與E-cadherin和vimentin的表達，結果顯示：KISS1與E-cadherin的表達呈正相關(r=0.534，P<0.05)，KISS1與vimentin的表達呈負相關(r=-0.611，P<0.05，表2)。

表2 KISS1表達與E-cadherin、vimentin表達的相關性

2.4 肺腺癌中KISS1、E-cadherin及vimentin表達與患者預后的關系本組中位生存期顯示：KISS1陽性組26個月，陰性組19個月；E-cadherin陽性組26個月，陰性組21個月；vimentin陽性組20個月，陰性組26個月。根據肺腺癌患者的預后資料分析患者的3年生存率，結果顯示：KISS1陽性組顯著高于陰性組(χ2=9.226，P=0.002)；E-cadherin陽性組顯著高于陰性組(χ2=5.140，P=0.023)；vimentin陽性組顯著低于陰性組(χ2=5.903，P=0.015，圖2)。

圖2 肺腺癌中KISS1(A)、E-cadherin(B)、vimentin(C)表達與患者預后的關系

3 討論

大多數肺癌患者確診時多為中晚期且預后較差，因此對肺癌發生、發展中的分子機制研究具有重要意義。在結直腸癌、胃癌等腫瘤中，KISS1突變或者表達下調可促進腫瘤發生及進展[4-5]，但在肺腺癌中與EMT相關因子(E-cadherin、vimentin)表達的相關性尚未見報道，與患者預后的關系也尚存在爭議。

KISS1是最先在黑色素瘤細胞中發現的腫瘤抑制基因，位于染色體1q32～q41區，在腫瘤的發生、發展中具有重要意義[6]。Guzman等[7]研究發現KISS1在胰腺癌和卵巢癌發展的初始階段上調起抑癌作用。然而，當KISS1被某些機制(如啟動子高甲基化)下調后，患者的預后較差。本實驗結果發現肺腺癌腫瘤組織中KISS1陽性率(48.5%)遠低于癌旁組織(90.3%)，與上述研究結論相吻合，進一步驗證了KISS1可能作為肺腺癌的潛在抑癌基因，進而抑制腫瘤的浸潤、轉移。Zheng等[8]研究發現KISS1 mRNA和蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織學類型無相關性，而與臨床分期、有無遠處轉移有顯著相關性。本實驗結果與Zheng等報道一致，進一步表明KISS1下調或突變缺失促進了肺腺癌的進展。本實驗結果顯示，肺腺癌患者KISS1陽性組3年生存率顯著高于陰性組，差異有統計學意義(P<0.05)。

腫瘤浸潤、轉移是多分子、多基因相互作用的結果，其中EMT是重要的步驟之一。EMT是指上皮性的細胞(包括正常上皮和腫瘤上皮)表現出間質細胞的特征，獲得了遷徙、運動能力[9]。EMT是正常胚胎發育的過程，同樣也是最常見的腫瘤浸潤與轉移的起始原因，其標志特征是上皮細胞完整性的丟失，而這種丟失會伴隨維持上皮細胞間接觸的黏附連接下降[10-11]。E-cadherin和vimentin是癌細胞EMT表面和支架的典型代表標志物，E-cadherin蛋白主要參與細胞間質之間特異性黏附連接過程，其功能的缺失與各種惡性上皮源性腫瘤的不良預后顯著有關。胡麗霞等[12]研究發現E-cadherin mRNA和蛋白在乳腺癌組織中呈陰性；其蛋白表達與臨床分期、脈管侵襲、組織學分級等表達間差異均有顯著性，可能參與乳腺癌的浸潤與轉移。本研究發現在肺腺癌組織中，E-cadherin蛋白與KISS1蛋白表達呈正相關；推測其表達可能與腫瘤分化程度、脈管累及、遠處轉移、TNM分期相關，與胡麗霞等在乳腺癌組織中的研究結果相吻合。

當細胞發生EMT時細胞極性喪失、細胞間連接解體、肌動蛋白骨架改變等一系列變化，導致細胞表面上皮標志物E-cadherin等表達逐漸降低，而間充質標志物不斷升高，基膜降解最終使細胞獲得遷移和侵襲從而發生浸潤轉移[13-14]。本實驗E-cadherin在低分化、有浸潤轉移及TNM分期較晚的肺腺癌組中陽性率降低，提示在腫瘤的發展過程中隨著其丟失或陰性，腫瘤細胞間的黏附力下降，促進EMT的發生。vimentin在正常上皮細胞中不表達，但在TNM分期較晚、低分化、有淋巴結轉移的肺腺癌細胞中過表達，同樣可增加EMT活性[15]。經過EMT的細胞失去了它們的上皮細胞特征，表達間充質標志物特性[16]。vimentin在癌組織中過表達后促進癌細胞遷移、運動，減弱細胞黏附，且無法維持細胞完整性，最終導致癌細胞轉移，嚴重影響患者預后。本組相關性分析顯示，vimentin與KISS1蛋白表達呈負相關，提示在肺腺癌組織中E-cadherin陰性和vimentin陽性與腫瘤組織的浸潤、轉移有關。因此，E-cadherin表達下調及vimentin表達上調在浸潤轉移中發揮重要作用，同時提示患者預后較差。文獻報道KISS1抑制間皮瘤細胞EMT的發生，抑制了腫瘤的浸潤及轉移。但是，KISS1與EMT的關系在肺腺癌研究中尚未見報道。本實驗探討了KISS1與EMT表達的關系，發現隨著KISS1表達的降低，E-cadherin表達下調而vimentin表達上調。因此，作者認為肺腺癌中KISS1表達下調參與EMT的發生，具體通過哪種通路促進EMT發生有待后續進一步分析。

綜上所述，KISS1可能作為一種抑癌基因參與肺腺癌的發生、發展，表達降低可誘導EMT發生，進而促進腫瘤的增殖、侵襲與轉移導致患者預后較差，但具體分子機制尚需進一步證實。