基于響應面法的粘質沙雷氏菌BRC-CXG2發酵培養基優化

李金榮, 周彤, 林一琪, 黃祚驊, 盛亮菁, 張飛萍, 吳松青

（1.福建農林大學林學院, 福州 350002；2.福建農林大學生命科學學院, 福州 350002；3.福建農林大學生態公益林重大有害生物防控福建省高校重點實驗室, 福州 350002）

松材線蟲病又稱松樹萎蔫病（pine wilt disease）, 是 由 松 材 線 蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的檢疫性森林病害, 具有傳播速度快、防治難度大等特點, 不僅給我國林業造成巨大的經濟損失, 也對景觀生態造成了嚴重破壞[1]。據報道, 在松材線蟲的傳播和感染的過程中, 松墨天牛起著攜帶、擴散和協助病原侵入寄主的關鍵性作用, 被認定為松材線蟲病的主要媒介昆蟲[2-3]。粘質沙雷氏菌既是松材線蟲的主要伴生細菌[4-5], 又是松墨天牛腸道的優勢菌, 且該菌對松墨天牛具有一定的殺蟲活性[6]。一方面其可以促進天牛生長, 另一方面又為機會致病菌。因此, 可利用該菌的伴生和致病能力對松墨天牛進行生物防治, 具有很強的生防潛力。

為了進一步開發粘質沙雷氏菌（Serratia marcesens)的應用潛能, 需要對其進行大量培養, 以滿足大規模的生產實踐需求, 因此, 本研究將對該菌發酵培養基進行篩選與優化。粘質沙雷氏菌培養基優化方法不一, 主要包括正交試驗設計法、單因素試驗優化以及與其相結合的響應面試驗設計法。郝林華等[7]采用正交試驗設計, 優化以葡萄糖、硫酸銨、麩皮、檸檬酸三鈉等作為粘質沙雷氏菌的培養基, 最終發酵菌含量為50×108cfu·mL-1；布佐日古麗·喀迪爾等[8]采用單因素試驗優化了粘質沙雷氏菌XJU-PA-6的最佳發酵條件, 最佳碳源為麥芽糖, 最佳氮源為蛋白胨, 優化后培養基的菌體生物量大概為8.7 g·L-1, 是基礎培養基的3.10倍。但為了實現工業化生產, 進一步提升其發酵水平, 加速其發酵過程, 本研究采用更為快速經濟的培養基優化方法——響應面法[9], 對粘質沙雷氏菌的培養基進行優化, 以期篩選出最優化的培養基配方,為粘質沙雷氏菌工程菌的規模化發酵生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 試驗所用粘質沙雷氏菌BRC-CXG2菌株由本課題組前期分離自松墨天牛二齡幼蟲腸道并保存[6]。

1.1.2 主要試劑和培養基 蛋白胨（分析純）、酪素（化學純）購自國藥集團化學試劑有限公司；麥芽提取粉、酵母提取粉（生化試劑）購自廣東環凱微生物科技有限公司；硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸銨均為分析純, 購自天津市恒興化學試劑制造有限公司；胰蛋白胨、酵母粉均為分析純, 購自OXOID有限公司；瓊脂粉購自北京蘭杰柯科技有限公司；黃豆餅粉購自北京鴻潤寶順科技有限公司。

種子液LB培養基：胰蛋白胨10 g·L-1, 酵母粉5 g·L-1, 氯化鈉10 g·L-1, pH 7.1~7.3, 121℃滅菌20 min；固體LB培養基：胰蛋白胨10 g·L-1, 酵母粉5 g·L-1, 氯化鈉10 g·L-1, 按1.5%的比例加入瓊脂粉, pH 7.1~7.3, 121℃滅菌20 min, 倒板備用；初始發酵培養基：黃豆餅粉5 g·L-1, 酪素10 g·L-1, 蠶 蛹 粉10 g·L-1, 磷 酸 氫 二 鉀2 g·L-1, 氯 化 鈉2 g·L-1, pH 7.1~7.3, 121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器設備MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器, 松下健康醫療器械株式會社；HYG-A全溫搖瓶柜, 蘇州市培英實驗設備有限公司；DHG-9030A電熱鼓風干燥箱, 上海一恒科學儀器有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱, 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺, 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；NBL 214e電子天平, 艾德姆衡器（武漢）有限公司；ST3100實驗室pH計, 奧豪斯儀器（常州）有限公司；LEICA M205 FA全自動熒光立體顯微鏡, 徠卡微系統有限公司。

1.2 試驗方法

在無菌條件下, 取粘質沙雷氏菌（BRCCXG2）的保存菌液按體積分數1%的量接種于5 mL的LB液體培養基中, 置于30℃、200 r·min-1搖床中培養12 h。然后將種子液按體積分數1%的接種量轉接到裝有50 mL發酵培養基的250 mL的錐形瓶中, 在28℃、150 r·min-1培養36 h后, 采用稀釋平板計數法[10], 通過LEICA M205 FA全自動立體顯微鏡統計菌落數量。

將發酵好的菌液梯度稀釋10-1~10-15倍, 各吸取100μL均勻涂布在固體LB培養基上, 靜置5 min, 待培養基表面干燥后封口, 放入溫度為28℃生化培養箱中倒置培養12 h, 每個梯度重復3次, 統計單菌落數量。

1.3 單因素試驗

基于初始發酵培養基, 分別設置不同溫度（25、28、30和37℃）、不同裝液量（25、50、100 mL/250 mL）及不同轉速（150、200、230 r·min-1）, 研究發酵條件對粘質沙雷氏菌發酵菌落數的影響。

參照初始發酵培養基, 設置單因素試驗研究培養基成分對粘質沙雷氏菌發酵菌落數的影響。分別設置2.5、5.0、10.0 g·L-1的碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、油酸、淀粉）；10、20、40 g·L-1的氮源（硫酸銨、酵母粉、乙酸銨、蛋白胨, 再分別添加酪素和蠶蛹粉）以及1、2、4 g·L-1的無機鹽（檸檬酸三鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸亞鐵）, 固定其他成分不變, 滅菌后按體積分數1%接種, 并在28℃、150 r·min-1的條件下培養36 h, 統計菌落數量。

1.4 Plackett-Burman試驗

根據單因素試驗結果, 采用Plackett-Burman（PB）試驗對影響粘質沙雷氏菌BRC-CXG2菌落數量的因素進行評價[11]。11個因素的水平設置如表1所示, 每個因素分別設計低（-1）、高（+1）水平。X3、X6、X9表示的是虛擬變量, 用于考察試驗誤差。試驗次數為12次, 重復3次, 篩選出3個影響顯著的因素。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test

1.5 最陡爬坡試驗

根據PB試驗結果篩選出對菌株生長影響最顯著的因素, 分別為葡萄糖、蠶蛹粉和接種量。通過Design Experts 8.0.6軟件的Plackett-Burman分析功能對PB試驗結果進行顯著性分析, 從中篩選出 影 響 顯 著（P＜0.05）的 因 素, 基 于Plackett-Burman試驗分析擬合出的顯著性方程設置最陡爬坡試驗中3個影響因素的爬坡方向和步長間距, 以期逼近最佳響應區域。

1.6 響應面分析與驗證試驗

根據最陡爬坡試驗結果確定其最適質量濃度范圍, 運用Box-Behnken試驗設計, 對培養基的每個因素條件進行優化。通過二階設計原理, 3因素（葡萄糖、蠶蛹粉及接種量）各取3水平（-1, 0, 1）, 共設計了17個組合的響應面試驗[12-13]。其中包括5個中心點, 試驗重復3次, 以確定各因素對菌株BRC-CXG2菌體生長量影響的顯著性和最適質量濃度范圍。然后對Box-Behnken試驗結果進行方差分析, 擬合線性回歸方程。利用擬合方程得到最佳培養條件, 并在此條件下進行驗證試驗。

1.7 數據處理

使用Excel 2020進行數據統計、作圖與分析, 分別用Design Experts 8.0.6、Origin 2021、GraphPad Prism 9與IBM SPSS Statistics 22。

2 結果與分析

2.1 不同培養條件對發酵菌落數的影響

圖1結果顯示, 溫度過高或過低都不利于粘質沙雷菌體的生長, 溫度在28℃時菌落數最高, 為32.9×107cfu·mL-1, 因此, 28℃為最適菌株生長溫度。裝液量為50 mL時, 發酵菌落數均高于裝液量25 mL和100 mL, 因此裝液量最適體積分數為50/250 mL；當轉速達到230 r·min-1時該菌菌落數最高, 但考慮搖床長時間處于該轉速工作時可能出現的安全性問題, 故選擇150 r·min-1進行培養基優化。

圖1 不同溫度、裝液量和轉速下的粘質沙雷氏菌菌落數Fig.1 Colonies number of Serratia marcescens under different temperatures, loading volumes and rotational speeds

2.2 單因素對菌落數量的影響

2.2.1 不同碳源對粘質沙雷氏菌菌落數量的影響 將不同種類及質量濃度碳源分別替換初始培養基中的黃豆餅粉, 對粘質沙雷氏菌的菌落數進行統計。結果（圖2）表明, 油酸為10.0 g·L-1的條件下菌落數最大, 為1.42×109cfu·mL-1, 但與葡萄糖的結果（1.39×109cfu·mL-1）差異并不明顯。當碳源含量為5.0 g·L-1時, 葡萄糖對發酵菌落數量的影響明顯大于其他碳源因子。考慮成本問題, 將葡萄糖與油酸同作為碳源加入到培養基中, 進一步優化比值。

圖2 不同碳源下的粘質沙雷氏菌菌落數量Fig.2 Colonies number of Serratia marcescens under different carbon sources

2.2.2 不同氮源對粘質沙雷氏菌菌落數量的影響 將不同種類及濃度氮源分別替換初始培養基中的酪素和蠶蛹粉, 對粘質沙雷氏菌的菌落數進行統計。結果（圖3）表明, 初始發酵培養基氮源40 g·L-1時的菌落數量最大, 為9.7×108cfu·mL-1, 但從生產成本的角度考慮, 酪素的價格較為昂貴, 不符合大規模生產實踐要求, 故選擇菌落數為7.8×108cfu·mL-1的蠶蛹粉和20 g·L-1的酵母粉組合作為粘質沙雷氏菌的最佳氮源。

圖3 不同氮源下的粘質沙雷氏菌菌落數量Fig.3 Colonies number of Serratia marcescens under different nitrogen sources

2.2.3 不同無機鹽對粘質沙雷氏菌菌落數量的影響 將不同種類無機鹽分別替換初始培養基中的磷酸氫二鉀, 對粘質沙雷氏菌的菌落數進行統計。結果（圖4）表明, 加入2.0 g·L-1的硫酸鎂, 發酵菌落數值最高為1.11×109cfu·mL-1。同時, 磷酸鹽類在培養基中起著調節pH及緩沖等重要作用。由于磷酸氫二鉀與硫酸鎂混合會生成磷酸氫鎂沉淀, 磷酸氫二鈉與硫酸鎂則不發生反應。故用于Plackett-Burman設計的無機鹽分別是硫酸鎂和磷酸氫二鈉。

圖4 不同無機鹽下的粘質沙雷氏菌菌落數量Fig.4 Colonies number of Serratia marcescens under different inorganic salt sources

2.3 Plackett-Burman試驗設計與檢測結果分析

表2所示的是Plackett-Burman試驗設計方案與菌落數檢測結果。將所得到的結果進行擬合, 方程模型如下。

表2 Plackett-Burman試驗設計方案與檢測結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman test

根據該方程可知, 因素X1（油酸）、X2（葡萄糖）、X4（蠶蛹粉）、X10（接種量）分別呈現不同的正（+）負（-）系數, 即X1（油酸）為負效應系數, 當加入油酸到一定量時, 則菌落數依次減小；X2（葡萄糖）、X4（蠶蛹粉）和X10（接種量）均為正效應系數, 依次增大。

方差分析（表3）表明,R2=0.983 9, 說明這個模型的結果僅有1.61%不可信。且該模型的P值為0.013 1, 模型顯著（P＜0.05）, 說明模型擬合良好。在8個變量中, 對菌落數量影響較顯著（P＜0.05）的4個因素從大到小為：蠶蛹粉＞葡萄糖＞接種量＞油酸。由于油酸生產成本偏高, 不再考慮優化。因此, 確定葡萄糖、蠶蛹粉與接種量為影響菌落數量的重要因素, 進行最陡爬坡試驗。

表3 Plackett-Burman試驗方差分析Table 3 Analysis of variance for the Plackett-Burman test

2.4 最陡爬坡試驗設計與結果

本試驗將培養基成分設計了6個水平（表4）, 隨著葡萄糖、蠶蛹粉和接種量值的增加, 發酵菌落數呈現先升高后下降的變化趨勢, 4號的菌落數達到最大值34.37×108cfu·mL-1, 因此確定為因子的最大響應值響應區域, 然后圍繞此區域設計Box-Behnken試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Design and results from the steepest ascent experiment

2.5 響應面分析優化培養基組成與方差分析結果

根據PB設計和最陡爬坡試驗結果（表5）, 分別確定3個最重要因素和最佳質量濃度范圍, 以菌落數（Y）為響應值,X1（葡萄糖）、X4（蠶蛹粉）、X10（接種量）為自變量, 采用中心組合設計進行Box-Behnken試驗。通過響應面分析可以得到多元二次回歸方程。

表5 響應面分析法試驗設計與結果Table 5 Experimental design and results of response surface analysis method

結合回歸分析（表6）, 該模型的P值為0.000 5（P＜0.01）, 失擬項影響不顯著（P=0.611 7＞0.05）,相 關 系 數（R2）為0.957 0, 校 正 系 數（Radj2）為0.901 7, 說明模型的擬合度較好。模型顯著性由大到小排序：X（1葡萄糖）＞X（4蠶蛹粉）＞X1（0接種量）。一次項X（1葡萄糖）和二次項X12、X42、X102對響應值Y（菌落數）影響極顯著（P＜0.01）, 交互項X1X4和X4X10顯著影響Y值（P＜0.05）, 一次項X4和X10與交互項X1X10對菌落數影響不顯著（P＞0.05）。

表6 響應面方差分析的回歸模型Table 6 Regression model for response surface analysis of variance

由圖5可知, 各個因素交互作用對菌落數影響的響應曲面為拋物線狀, 形狀輪廓圖則表示獨立變量間的顯著性。輪廓圖呈橢圓形, 說明各個因素之間相互作用會影響Y（菌落數）。

如圖5A所示,X1（0接種量）值固定不變,X（1葡萄糖）和X（4蠶蛹粉）對發酵菌落數的影響表明, 當X1值為最低質量濃度時,Y值先隨著X4值的升高而增加；當X1的值超過最適質量濃度時,Y值隨著X4值的升高而下降,Y值的響應面呈現峰值, 即邊界的設置包含最優點。如果沒有得到完整的橢圓形狀的等高線圖, 說明邊界的設計不包含最優點。當X4值保持不變時,X1和X10對Y值的影響如圖5B所示。X1值較低時, 隨著X10的提高,Y的值呈明顯的拋物線狀, 先增加達到最優時最大, 后下降。同理,X1值不變,X2和X3均出現各自的最優值, 使Y達到峰值（圖5C）。而3個曲面的頂點反映菌落數的最高點即最佳培養基成分與最佳用量。

圖5 各因素交互作用下菌落數的響應面及等高線Fig.5 Response surface and contour plots of colony number under the interaction of various factors

通過分析等高線圖可得到預測最優值。預測最 優 條 件 為：23.27 g·L-1葡 萄 糖、22.37 g·L-1蠶蛹粉和4.73 %接種量, 預估的菌落數為5.67×109cfu·mL-1。故最終培養基成分及培養條件為：23.27 g·L-1的葡萄糖、22.37 g·L-1的蠶蛹粉、10 g·L-1酵母粉、2 g·L-1硫酸鎂、3 g·L-1磷酸氫二鈉、2 g·L-1氯化鈉, 28℃、150 r·min-1條件下發酵36 h, 培養基裝液量體積分數為50 mL/250 mL, 接種4.73%的菌液。

2.6 優化后培養基的發酵結果

按所得到的最優培養基配方進行發酵, 驗證所預測的菌落數是否準確。試驗所獲得的平均菌落數是6.0×109cfu·mL-1, 與預 測菌落數結果（5.67×109cfu·mL-1）非常接近。因此, 可以證明這個模型準確性較高, 可預測實際發酵情況。此外, 結果表明, 最優培養基發酵的菌落數（6.0×109cfu·mL-1）在現有的最佳培養基基礎上（6.37×108cfu·mL-1）提 高 了9.42倍, 達 到 預 期目標。

3 討論

優化發酵微生物培養基是提高生物防治效果的重要手段[14]。優化內容主要包括培養基的組成成分與培養條件, 如溫度、pH、發酵時間、裝液量等因素對發酵菌體生物量有著不同程度的影響, 有研究發現培養基的主要成分以及各因素之間的相互作用對粘質沙雷氏菌發酵具有極其重大的影響[7,15-16], 與此同時培養溫度在菌體生長過程中也發揮著至關重要的作用。

郝林華等[7]對分離于濕地鹽堿灘地土壤的粘質沙雷氏菌進行發酵, 主要是對該菌培養基的碳、氮源及無機鹽進行優化, 其優化培養基配方中碳、氮源與無機鹽的成分含量分別是葡萄糖10 g·L-1, 硫酸銨5 g·L-1, 麩皮50 g·L-1, 檸檬酸三鈉1 g·L-1, 最終發酵菌數為50×108cfu·mL-1, 發現碳氮源及兩因素之間的交互作用對菌體生長影響較大, 而無機鹽次之。薛建等[15]研究的粘質沙雷氏菌篩選于光合細菌菌劑, 對該菌培養基種類和用量進行優化發現, 5 g·L-1的黃豆粉作為碳源時,菌體生長量是原來基礎培養基的1.72倍, 以10 g·L-1酪素和蠶蛹粉作為氮源, 生物量比原來分別提升了2.04和2.16倍, 以2 g·L-1磷酸氫二鉀作為無機鹽, 發現菌體產量是之前的1.15倍。由此說明, 對該菌發酵菌液影響最大的是氮源, 其次為碳源和無機鹽。李元芳等[16]優化粘質沙雷氏菌產2,3-丁二醇培養基時發現80 g·L-1蔗糖、5 g·L-1酵母粉及0.07 g·L-1硫酸錳及10 g·L-1檸檬酸對菌體生物量的提高起著重要作用, 按影響從大到小依次排序為檸檬酸＞酵母粉＞硫酸錳＞蔗糖。即檸檬酸和氮源對發酵產量影響最大, 其次為無機鹽和碳源。

本研究中發酵的粘質沙雷氏菌分離自松墨天牛幼蟲腸道, 影響因素重要性由大到小分別為氮源＞碳源＞無機鹽, 這與郝林華等[7]和薛建等[15]的研究結果一致。與李元芳等[16]的研究結果區別在于碳源與無機鹽對發酵生物量影響程度的差異, 其研究表明無機鹽對菌體生長的重要性大于碳源因子, 而本研究結論與之相反, 原因可能是由于試驗目的差異性, 前者研究目的是如何使粘質沙雷氏菌產大量2,3-丁二醇, 所以對培養基的成分選擇上更多的考慮如何促進2,3-丁二醇的產量, 而非提高菌體自身生物量, 其研究表明無機鹽在細胞代謝過程中起著至關重要的作用, 因此2,3-丁二醇的產出對無機鹽營養需求大于對碳源的需求量。然而, 本研究以提高菌體自身產量為目標, 這與郝林華等[7]研究目的一致, 由于碳源作為生命體生長繁殖所必需的基本營養物質, 在菌體自身繁殖與合成中起著非常關鍵的作用。所以, 菌體對碳源的需求要大于無機鹽。

另外, 本研究發現培養條件也是影響菌體生長的關鍵因素。尤其是溫度對菌體自身繁殖起著極其重要的作用[17-18]。譚文章等[19]報道, 粘質沙雷氏菌在4~37℃的環境下均能生長, 但在37℃的條件下生長最佳。還有學者探究溫度對菌體生長的影響表明該菌的生存范圍為20~40℃[20], 但趙銀娟等[17]研究發現, 從土壤中分離到的粘質沙雷氏菌最適生長溫度為28~30℃；祁正華等[21]對粘質沙雷氏菌培養條件進行了優化, 該菌株于健康人皮膚分離且經過生物技術誘導, 該菌最佳生長溫度為30℃。前人對菌體生長影響因素的重要性及最佳培養溫度報道不一, 其原因可能是不同產地不同來源的菌株間存在特異性, 故菌株所需的營養成分含量和培養條件也會存在差異。

綜上所述, 本研究得到最優配方與培養條件為23.27 g·L-1的葡萄糖, 22.37 g·L-1的蠶蛹粉, 10 g·L-1酵母粉, 2 g·L-1硫酸鎂, 3 g·L-1磷酸氫二鈉, 2 g·L-1氯化鈉；在28℃、150 r·min-1條件下發酵36 h, 裝入50 mL/250 mL培養基, 接種量為4.73 %, pH 7.1~7.3, 菌落數達到60×108cfu·mL-1。郝林華等[7]優化后的活菌數為50×108cfu·mL-1, 與之相比不僅產量上有所提升, 而且發酵時間也縮短了一半, 從而大大節約了時間成本, 使發酵過程變得更加高效、高產, 為后續粘質沙雷氏菌生物工程菌劑的應用提供重要技術支撐。