不同成熟期鮮食水稻中蛋白質的營養消化特性研究

宋雪健， 王欣卉， 李 丹，2， 李志江， 周 義, 張愛武, 張東杰

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319) (糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心2，大慶 163319)

人們對“亮度、精度、白度”的追求使谷物存在過度加工現象，導致營養及功能性成分損失，因此，包含了麩皮、胚芽及胚乳等未研磨、粉碎的鮮食全谷物食品研究成為熱點。目前對于鮮食玉米[1]、鮮食大豆的研究較為廣泛。Kim等[2]研究了紫糯玉米籽粒灌漿期花色素苷和氨基酸含量及脂肪酸組成，發現籽粒灌漿過程中，隨著籽粒顏色變暗，花青素含量增加。Muller等[3]對新鮮大豆中的呋喃脂肪酸進行研究發現，3種呋喃脂肪酸在試樣新鮮大豆中都被定量鑒定。水稻的成熟過程包括乳熟期(前期、中期、后期)、蠟熟期、完熟期5個過程。取食鮮嫩的籽粒或者乳熟期的新鮮果穗的水稻被稱為鮮食水稻。Jiamyangyuen等[4]對來自泰國的2種白米、黑米及紅米共計4種稻米，在水稻成熟過程中經歷的5個時期的原花色素、花青素、總酚及總黃酮等指標進行研究，結果發現抗氧化活性與生物活性成分高度相關。李洪亮等[5]對不同時期的鮮食水稻研究發現，在乳熟后期時多糖對ABTS+·的清除率為86.18%、羥基自由基的清除率為75.62%，均高于其他時期。曲鵬宇等[6]研究發現在水稻成熟過程中水溶性膳食纖維含量逐漸變低，乳熟中期水稻莖中的水溶性膳食纖維質量分數最高為3.40%，成熟期籽粒最低為0.50%。水稻中蛋白質的含量是評價其品質的重要指標之一[7]，鮮食水稻還處于成熟階段，具有較高生物活性的小分子蛋白質含量較高，因此，對鮮食水稻蛋白質的研究是非常有必要。

蛋白質需要通過腸胃中的酶消化后，分解成小肽的形式才能被體內消化吸收。體內評價方法雖然有著更高的準確性，能反應食物在體內的具體變化情況，但其方法有著實驗周期長，經費高，結果重現性差、受個體差異影響大等問題[8]。體外模擬消化具有操作簡單、廉價、實驗周期短、可重復性高等特點[9]，常被應用在食物蛋白質的消化機理研究中，其模式可分為體外模擬胃、腸道、總消化3種[10]。王章存等[11]表明高壓預處理大米蛋白有利于酶解產生更高抗氧化活性的大米肽。佟立濤等[12]研究發現，通過體外消化后的大米蛋白具有較好的生物活性，如抗氧化活性高，并通過對蛋白質酰化、微波及兩者結合的方法可以提高蛋白質的消化率。通過前期研究工作發現，乳熟期的鮮食水稻中蛋白質由分子質量為10～25 ku小分子組成，完熟期蛋白質由分子質量為10～25、55、70、100 ku蛋白分子組成，隨著水稻的逐漸成熟，鮮食水稻中的蛋白質分子逐漸增大。在前期工作的基礎上，本研究以鮮食水稻為研究對象，對其在5個不同成熟時期的蛋白質的抗氧化活性及氨基酸組成、評分、體外模擬消化等營養進行研究，為今后對鮮食水稻整體評價及應用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要試劑

水稻樣品均采自黑龍江省鶴崗市寶泉嶺名山農場。選擇黑龍江省種植較為廣泛的水稻品種龍粳31號在不同的成熟期(乳熟前期、乳熟中期、乳熟后期、蠟熟期、完熟期)作為實驗的材料。采收后樣品均置于-20 ℃冷庫冷藏保存，全部采收結束后由冷鏈車運輸至實驗室冷庫中儲藏12 h。羥自由基測試試劑盒BR級；總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(ABTS+·法)微板法BR級；抑制與產生超氧陰離子自由基測試試劑盒(比色法)BR級；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)AR級；維生素C標準品AR級；1∶3 000胃蛋白酶；1∶250胰蛋白酶；磺基水楊酸AR。

1.2 實驗設備

TU-1810型紫外可見分光光度計，HWS24型電熱恒溫水浴鍋，YB-1000A型高速多功能粉碎機，Beta2-8LD plus型冷凍干燥機，THU35C型SATAKE實驗礱谷機。

1.3 實驗樣品前處理及蛋白質提取

實驗對篩選出顆粒飽滿，無霉斑、蟲害的稻谷進行礱谷，磨粉過80目篩，并用石油醚脫脂：取稻米粉適量，在室溫下按液料比3∶1 mL/g加入石油醚，攪拌脫脂5 h，靜止1 h后分層，去除上層的石油醚，將下層的沉淀成分，置于通風櫥中直至石油醚揮發完，進而得到了全脫脂的鮮食水稻粉。

向鮮食水稻粉中加入一定量的蒸餾水，用1 mol/L的NaOH溶液調節pH至7.5，在特定的溫度下進行攪拌浸提后，在3 200 r/min的條件下離心20 min，取出上層清液，用1 mol/L的HCl溶液調節pH至4.5，繼續在3 200 r/min的條件下離心20 min后，對沉淀物質進行水洗得到沉淀物質，重復3次以上操作，冷凍干燥，即得到鮮食水稻蛋白質。

1.4 蛋白質含量測定

根據凱氏定氮法測定蛋白質含量。

1.5 氨基酸組分分析

氨基酸測定條件：緩沖液流量20 mL/h，茚三酮流量10 mL/h，柱溫58 ℃和135 ℃，色譜柱20 cm，分析時間32 min ,標準峰保留時間為20 min左右，具體方法參考[13]。

1.6 鮮食水稻成熟過程中蛋白質抗氧化活性的變化

1.6.1 ABTS+·自由基清除能力的測定

按照總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(ABTS+·法)微板法說明書進行操作，測定抗氧化能力。取2支試管(A為測試管和B為對照管)并分別加入1 mL的試劑1，在A中加入0.2 mL的鮮食水稻待測樣，分別向A、B試管中加入2 mL試劑2和0.5 mL試劑3，混勻后置于37 ℃的水浴中30 min，向A、B試管中加入0.2 mL試劑4，向B管中0.2 mL的鮮食水稻待測樣，再向A、B試管中各加入0.2 mL試劑5，混勻，靜置10 min后用蒸餾水進行調零，在520 nm波長處測定樣品的光密度值[14]。

T-AOC=

(1)

1.6.2 DPPH·清除率的測定

參照Phongthai等[15]的方法對DPPH自由基清除能力進行測試，0.2 mg/L的DPPH溶液現配現用，并在517 nm波長處測定吸光度，按式(2)計算DPPH·清除率。

(2)

1.6.3 對·OH清除率的測定

參照Li等[16]的方法對·OH清除率進行測定，在37 ℃水浴條件下反應30 min，在536 nm波長處測定吸光度。

(3)

1.6.4 超氧陰離子自由基清除率測定

在37 ℃的水浴條件下，將含有4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl(pH值為8.2)緩沖液的試管恒溫30 min后，分別加入0.5 mL 25 mmol/L鄰苯三酚，選用蒸餾水來代替本底管，在37 ℃水浴條件下向樣品管和本底管中加入不同體積樣品，混勻，充分反應5 min，再用1 mL 0.2 mol/L HCl溶液來終止反應，測定在420 nm波長下的吸光度。

(4)

1.7 鮮食水稻蛋白質成熟過程中蛋白質的營養消化

1.7.1 氨基酸評分

將已知的必需氨基酸含量換算為每個蛋白質中所含氨基酸含量后，與1973年FAO/WHO建議的每個氮氨基酸評分標準模式[17]和中國預防醫學院提出的雞蛋蛋白質評分標準進行比較分析[18]，按式(5)～式(7)計算氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)和必需氨基酸指數(EAAI)。

AAS=

(5)

CS=

(6)

(7)

式中：aa1，aa2，aa3，…，aai分別表示蛋白質中的必需氨基酸的比率(A/E)；AA1,AA2,AA3，…，AAi：分別表示整個雞蛋中蛋白質的必需氨基酸比率；n表示必需氨基酸的個數，實驗中為7。

1.7.2 體外模擬胃消化

參照吳偉等[19]的方法進行體外模擬胃消化實驗，在37 ℃的條件下取質量分數為1%的蛋白溶液(用蒸餾水配制，下同)預熱10 min后，1 mol/L HCl調pH為3，每100 mL溶液中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為3×106U，下同)，在37 ℃的條件下振蕩消化水解1.5 h，用1 mol/L NaOH調節pH為7，進行滅酶處理，即可測得蛋白質的胃消化率。

1.7.3 體外模擬腸消化

參照任大喜等[20]研究進行體外模擬腸消化實驗，將濃度為1%的蛋白溶液置于37 ℃的水浴條件下，預熱10 min，用1 mol/L NaOH調pH為7，在每100 mL溶液中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為1.25×105U，下同)，在37 ℃的條件下振蕩消化水解2 h后，沸水浴下滅活5 min，即可測得蛋白質的腸消化率。

1.7.4 體外模擬總消化

參照Zhu等[21]的研究對體外模擬總消化進行測試，將質量分數為1%的蛋白溶液置于37 ℃的水浴條件下，預熱10 min，用1 mol/L HCl調pH為2，在37 ℃的恒溫搖床條件下，先加入胃蛋白酶進行消化水解1.5 h，用l mol/L NaOH調 pH為7，再加入胰蛋白酶進行消化水解2 h，然后用沸水浴進行滅活5 min，測得蛋白質的總消化率。

(8)

式中：m1為樣品蛋白質量/g；m0為消化后濾渣蛋白質量/g。

1.8 數據統計與分析

每組實驗重復3次，實驗所得數據使用SPSS 20版進行方差分析及鄧肯多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同成熟期鮮食水稻的蛋白質含量

不同成熟期鮮食水稻中蛋白質含量如表1所示。隨著灌漿的進行，蛋白質含量在乳熟期存在顯著性差異，蛋白質是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生物生長過程中的基礎營養素，乳熟前期蛋白質含量最高[22]，說明此時期的鮮食水稻處于生長的旺盛期。

表1 鮮食水稻成熟過程中蛋白質的含量 (g/100 g DW)

2.2 鮮食水稻成熟過程中蛋白質的抗氧化活性

2.2.1 ABTS+·清除能力

圖1 不同濃度下鮮食水稻蛋白質的ABTS+·清除能力

谷物蛋白質具有較好的抗氧化能力，機體的抗氧化能力強弱與健康程度存在著密切的聯系[23]。由圖1可知，隨著質量濃度的升高，VC與5個時期鮮食水稻蛋白質的總抗氧化能力均逐漸增強，VC與5個時期的鮮食水稻蛋白質的總抗氧化能力存在顯著性差異(P<0.05)，在1 000 μg/mL時，乳熟前期到完熟期總抗氧化能力為228.38、120.03、117.71、115.18、109.11 U/mg，每個時期間抗氧化活力變化趨勢不大。乳熟期的鮮食水稻蛋白質總抗氧化能力顯著高于完熟期是因為乳熟期的水稻還處于生長期，小分子蛋白含量要高于完熟期，而小分子蛋白質的總抗氧化活力高于大分子蛋白質，因此總抗氧化能力要高于完熟期。

2.2.2 DPPH·清除能力

穩定的DPPH基團在乙醇中顯示，在517 nm處吸光值為最大。當DPPH遇到含氫物質時，自由基將被清除，顏色從紫色變為黃色，并且吸光度降低[24]。可以得出，鮮食水稻蛋白質含有作為電子供體的氨基酸或肽，并且可以與自由基反應以將它們轉化為更穩定的產物并終止自由基鏈式反應。由圖2可知，VC與5個成熟期鮮食水稻蛋白質都具有一定的DPPH·清除能力，VC隨著濃度的增加，其DPPH·清除能力基本保持不變；5個不同成熟時期鮮食水稻蛋白質隨著樣品濃度的增加，DPPH·清除能力液隨之增加。VC與5個時期的鮮食水稻蛋白質的DPPH·清除能力存在顯著性差異(P<0.05)。在相同質量濃度下5種不同時鮮食水稻蛋白質DPPH·清除能力順序為：VC>乳熟前期>乳熟中期>乳熟后期>蠟熟期>完熟期(P<0.05)。

圖2 不同濃度下鮮食水稻蛋白質的DPPH自由基清除率

2.2.3 ·OH清除能力

·OH基清除率是反應物質抗氧化活性的重要指標之一，Fenton反應體系是人體內產生·OH的重要途徑；·OH具有非常強的奪電子能力，是體內最活潑的活性氧，會造成很多病理性變化；因此，去除·OH可能是抵御許多疾病的有效方法[25]。由圖3可以看出，VC與鮮食水稻蛋白質都具有一定的·OH清除能力。VC與5個時期的鮮食水稻蛋白質的·OH基清除率存在顯著性差異(P<0.05)，VC質量濃度在100～600 μg/mL時，清除能力基本保持不變；而5個不同時期鮮食水稻蛋白質隨著質量濃度的增加，其·OH清除能力逐漸增加。在相同質量濃度下，VC清除·OH能力均高于不同時期鮮食水稻蛋白質。

圖3 不同濃度下鮮食水稻蛋白質的·OH清除率

2.2.4 超氧陰離子自由基清除能力

由圖4可知，隨著質量濃度的增加，VC與不同時期鮮食水稻蛋白都具有一定的超氧陰離子自由基的清除能力。隨著質量濃度的增加，VC與不同時期鮮食水稻蛋白質清除超氧陰離子自由基的能力逐漸增強。VC與5個時期的鮮食水稻蛋白質的超氧陰離子自由基的清除能力存在顯著性差異(P<0.05)，在1 000 μg/mL時，乳熟前期到完熟期抗超氧陰離子清除率分別為48.89%、47.95%、45.96%、38.35%、37.73%，可以看出在相同濃度下乳熟前期鮮食水稻蛋白質的抗超氧陰離子清除能力要高于完熟期，但均低于VC。

圖4 不同濃度下鮮食水稻蛋白質的超氧陰離子自由基清除率

2.3 鮮食水稻蛋白質成熟過程中蛋白質的營養消化

2.3.1 鮮食水稻蛋白氨基酸分類所占比例

由表2可知，5個不同時期的鮮食水稻中，乳熟前期TAA、EAA、HAA、BAA、DAA含量最高，分別為9.75、3.60、3.89、1.46、7.70 g/100 g，5個不同時期鮮食水稻的必需氨基酸含量分別占氨基酸總量較高的時期是乳熟中期；5個不同時期鮮食水稻的半必需氨基酸含量分別占氨基酸總量的17.53%、17.63%、17.65%、17.43%、17.68%；蛋白質的營養價值是由所含氨基酸的種類、比例和數量所決定，其中必需氨基酸含量和所占比例是決定蛋白質營養價值的主要因素。本實驗中，乳熟中期鮮食水稻的必需氨基酸占總氨基酸質量分數最高達到37.46%，EAA/NEAA(E/N)為0.599且與FAO/WHO提出的EAA/TAA約為40.00%接近[26]，高于完熟期的鮮食水稻，表明乳熟中期鮮食水稻中的蛋白質是一種品質良好的蛋白質。

表2 5個時期鮮食水稻蛋白質中氨基酸分類及所占比例/g/100 g

EAAI、AAS、CS是比較分析動物體必需氨基酸組成、衡量蛋白質營養價值的常用指標[27]。由表3可知，乳熟中期鮮食水稻的EAAI最高為84.79，其余5個時期依次為：82.92、84.04、84.02、83.25。根據AAS和CS評分可知，鮮食水稻中第一限制氨基酸為賴氨酸。EAAI可判定蛋白源對人體的營養價值，AAS為蛋白質中某一必需氨基酸占FAO/WHO模式中相應氨基酸含量的百分比，CS用來評價蛋白源中某一必需氨基酸的含量與標準雞蛋蛋白中相對應的必需氨基酸含量的接近程度[28]。本實驗證明鮮食水稻中氨基酸種類齊全，且乳熟中期的氨基酸營養價值高于完熟期的鮮食水稻。

2.3.2 體外模擬胃消化

消化率是機體消化吸收的食物量占食物總攝入量的百分比，是評價食物營養價值的重要指標之一。實驗以鮮食水稻蛋白質為實驗樣品，采用胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬人體胃腸道環境，對5個不同成熟時期的鮮食水稻蛋白質進行體外模擬胃、腸消化實驗，評價鮮食水稻蛋白質體外胃消化率、腸消化率以及總消化率。由圖5可知，在鮮食水稻成熟過程中，鮮食水稻蛋白質的體外模擬胃消化是呈現逐漸減低的趨勢。乳熟期前、中、后3個時期的鮮食水稻蛋白質體外模擬胃消化的變化不顯著(P>0.05)，而乳熟期與蠟熟期之間存在顯著性(P<0.05)變化，說明乳熟期鮮食水稻蛋白質在體外模擬胃消化率高于蠟熟期與完熟期的鮮食水稻蛋白質。但5個時期的鮮食水稻蛋白質在體外模擬胃消化環境下消化率均不高，均在40%以下，說明人體攝入的食物蛋白只有少部分在胃內進行消化，大部分的蛋白質在腸道中進行消化。

表3 不同時期鮮食水稻蛋白質必需氨基酸組成的評價/(mg/gN)

2.3.3 體外模擬腸道消化

由圖5可知，在鮮食水稻成熟過程中，鮮食水稻蛋白質的體外模擬腸道消化是呈現逐漸減低的趨勢。乳熟前期與中期鮮食水稻蛋白質的體外模擬腸道消化率不存在顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于蠟熟期與完熟期的鮮食水稻(P<0.05)，表明乳熟前期與中期的鮮食水稻蛋白質更易于人體吸收和利用。5種不同時期鮮食水稻蛋白質的體外模擬腸道消化率均接近于50%，尤其是乳熟前期的鮮食水稻蛋白質體外模擬腸道消化率48.46%，進一步說明人體攝入的食物蛋白質主要在腸道中進行吸收利用，這與Hamosh[29]的研究一致。

2.3.4 體外模擬總消化

由圖5可知，在鮮食水稻成熟過程中，鮮食水稻蛋白質的體外模擬胃消化是呈現逐漸減低的趨勢。乳熟期前、中、后3個時期的鮮食水稻蛋白質體外模擬胃腸總消化的變化不顯著(P>0.05)，均接近于75%，但顯著高于蠟熟期和完熟期鮮食水稻蛋白質的消化率，表明乳熟期的鮮食水稻蛋白質更能得到機體的吸收與利用，所以從蛋白質消化吸收角度來看，乳熟期的鮮食水稻營養價值更高。

注：同一消化階段標注字母相同表示無顯著性差異，字母不同表示有顯著性差異。圖5 不同時期鮮食水稻蛋白質體外模擬消化

3 結論

本研究以5個不同成熟時期鮮食水稻為實驗樣品，對各時期鮮食水稻中的蛋白質進行提取，并對抗氧化活性以及蛋白質功能特性進行研究發現，乳熟期的鮮食水稻蛋白質總抗氧化能力、DPPH·清除能力、·OH清除能力、超氧陰離子自由基清除能力均高于完熟期的鮮食水稻蛋白質，但均低于VC。稻米中氨基酸種類齊全，乳熟中期鮮食水稻的EAAI最高為84.79，鮮食水稻中第一限制氨基酸為賴氨酸，乳熟中期的氨基酸營養價值高于完熟期的鮮食水稻；乳熟期前、中、后3個時期的鮮食水稻蛋白質體外模擬胃、腸、總消化的變化不顯著(P>0.05)，總模擬消化接近于80%，顯著高于蠟熟期和完熟期鮮食水稻蛋白質的消化率，表明乳熟期的鮮食水稻蛋白質更能得到機體的吸收與利用，所以從蛋白質消化吸收角度來看，乳熟期的鮮食水稻營養價值更高。