大孔樹(shù)脂-磁場(chǎng)輔助溶劑結(jié)晶聯(lián)合純化紅松籽油甾醇的研究

王莉莉，包怡紅，趙慶佳，張 娜，郭慶啟,3

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院1，哈爾濱 150040) (哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院2，哈爾濱 150028) (黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，哈爾濱 150040)

植物甾醇屬于三萜烯化合物[1]，通常以游離甾醇或者由甾醇酯、甾醇糖苷和酰基化甾醇糖苷構(gòu)成的結(jié)合甾醇形式廣泛存在于各種堅(jiān)果、種子和植物油中[2,3]，其主要為豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇以及飽和形式的甾烷醇。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇具有降血脂[4]、預(yù)防心血管疾病[5]、抗腫瘤[6]以及減肥[7]等作用，在食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

目前有關(guān)植物甾醇提取的研究較多，主要有皂化法、超臨界CO2萃取法、層析法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等[8-11]，來(lái)源于油脂的植物甾醇粗提物因含有色素、脂肪酸等使其黏度較大，影響了其純度、功能以及綜合利用。對(duì)于植物甾醇純化的相關(guān)研究文獻(xiàn)報(bào)道較少，甾醇類(lèi)活性物質(zhì)的純化研究常采用分子蒸餾法、大孔樹(shù)脂法、溶劑結(jié)晶法等，分子蒸餾法是在高真空條件下利用料液中分子蒸發(fā)速率的不同進(jìn)行分離，此法操作復(fù)雜且物質(zhì)的回收率較低[12]，大孔樹(shù)脂法操作簡(jiǎn)便、純化效率高，環(huán)保可重復(fù)利用[13]，溶劑結(jié)晶法即利用活性物質(zhì)在某一溶劑中溶解度的不同從而使溶質(zhì)達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)而結(jié)晶析出，提高物質(zhì)純度，但需多次結(jié)晶后才可獲得純度較高的植物甾醇[14]；磁場(chǎng)輔助溶劑結(jié)晶即將傳統(tǒng)的結(jié)晶過(guò)程置于磁場(chǎng)環(huán)境中，借助磁場(chǎng)強(qiáng)度、時(shí)間和方向作用對(duì)分子和原子的聚集狀態(tài)、遷移速度和方向產(chǎn)生影響，增加物質(zhì)間的碰撞機(jī)會(huì)，通過(guò)對(duì)結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，有助于改善甾醇溶液的黏度、溶解度和表面張力，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)晶核形成和改善晶體品質(zhì)的目的。Gavira等[15]實(shí)驗(yàn)表明在磁場(chǎng)條件下會(huì)影響溶菌酶四方晶體的成核和生長(zhǎng)，許凱云等[16]利用磁場(chǎng)誘導(dǎo)結(jié)晶分離薄荷醇?jí)A，發(fā)現(xiàn)在磁場(chǎng)作用下結(jié)晶時(shí)間由10 h縮短至4 h。

本研究以紅松籽油甾醇提取物為原料，以吸附率和解吸率為指標(biāo)，篩選最佳樹(shù)脂型號(hào)，通過(guò)靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)，確定大孔樹(shù)脂純化紅松籽油甾醇的最適工藝條件；再以純度和結(jié)晶率為指標(biāo)，二次分離純化紅松籽油甾醇，確定純化工藝參數(shù)；最后通過(guò)光譜、氣-質(zhì)等技術(shù)對(duì)紅松籽油甾醇的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行表征和鑒定，以期為紅松籽油甾醇的制備及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松(PineskoraiensisL.)籽、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、溴化鉀(光譜純)、甲醇(色譜純)。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1900紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，Scientz-18N 冷凍干燥機(jī)，IS-RSDS臺(tái)式恒溫振蕩器，DCT 23-15 可調(diào)式電磁鐵，HT20 高斯計(jì)，F(xiàn)TIR-480 傅里葉變換紅外光譜儀，7890-5973N 氣質(zhì)聯(lián)用儀。

1.3 方法

1.3.1 紅松籽油甾醇提取物的制備

參考劉海霞等[9]方法制備紅松籽油甾醇粗提物。

1.3.2 紅松籽油甾醇含量與純度的測(cè)定

采用磷硫鐵顯色法進(jìn)行甾醇含量的測(cè)定[17]，樣品紅松籽油甾醇含量以膽固醇質(zhì)量計(jì)，mg/mL。以膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=4.910 5x-0.000 7，R2=0.999。按式(1)計(jì)算甾醇純度。

(1)

式中：C為紅松籽油甾醇含量/mg/mL；V為紅松籽油甾醇溶液體積/mL；m為紅松籽油甾醇質(zhì)量/mg。

1.3.3 大孔樹(shù)脂初次純化紅松籽油甾醇的研究1.3.3.1 大孔樹(shù)脂的篩選

取預(yù)處理后的樹(shù)脂2.00 g，加入30 mL紅松籽油甾醇提取液(0.15 mg/mL)，120 r/min、25 ℃振蕩吸附12 h后過(guò)濾，測(cè)定吸附液中紅松籽油甾醇含量。將樹(shù)脂用蒸餾水洗凈，用濾紙吸干水分，加入30 mL無(wú)水乙醇溶液，120 r/min、25 ℃振蕩12 h后過(guò)濾，測(cè)定解吸液中紅松籽油甾醇含量，按照式(2)～式(4)分別計(jì)算甾醇的吸附率、吸附量和解吸率。

(2)

(3)

(4)

式中：C0為紅松籽油甾醇初始含量/mg/mL；C1為吸附液中紅松籽油甾醇含量/mg/mL；C2為解吸液中紅松籽油甾醇含量/mg/mL；V1為吸附液體積/mL；V2為解吸液體積/mL；m1為樹(shù)脂的質(zhì)量/g。

1.3.3.2 AB-8樹(shù)脂對(duì)紅松籽油甾醇靜態(tài)吸附及解吸動(dòng)力學(xué)研究

取AB-8樹(shù)脂2.00 g，加入30 mL甾醇提取液，120 r/min、25 ℃振蕩吸附12 h，每1 h測(cè)定吸附液中甾醇含量。吸附結(jié)束后，過(guò)濾，將吸附飽和的樹(shù)脂用蒸餾水洗凈，加入30 mL無(wú)水乙醇進(jìn)行解吸，于120 r/min、25 ℃振蕩解吸12 h，每1 h測(cè)定解吸液中甾醇含量。

1.3.3.3 AB-8樹(shù)脂靜態(tài)/動(dòng)態(tài)吸附及解吸對(duì)甾醇純化效果影響的研究

取2.00 g AB-8樹(shù)脂濕法上柱，考察甾醇上樣質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、吸附流速、甾醇上樣量、解吸流速、解吸液體積對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響。

1.3.4 磁場(chǎng)輔助溶劑結(jié)晶二次純化紅松籽油甾醇的研究

將大孔樹(shù)脂純化的紅松籽油甾醇初次純化液在45 ℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，真空冷凍干燥。稱(chēng)取一定質(zhì)量的紅松籽油甾醇，按一定料液比加入結(jié)晶溶劑，回流加熱至溶解，趁熱過(guò)濾，冷卻至室溫。室溫條件下在固定磁場(chǎng)強(qiáng)度的磁場(chǎng)中結(jié)晶1 h，置于某一溫度下養(yǎng)晶一段時(shí)間，過(guò)濾，取少量溶劑沖洗濾渣，濾渣烘干后密封保存。考察結(jié)晶溶劑、料液比、養(yǎng)晶溫度、養(yǎng)晶時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響，按式(1)、式(5)計(jì)算紅松籽油甾醇純度和結(jié)晶率。

(5)

式中：m3為稱(chēng)取的大孔樹(shù)脂純化后的甾醇質(zhì)量/g；m4為結(jié)晶后的甾醇質(zhì)量/g；P1為大孔樹(shù)脂純化后甾醇的純度/%；P2為結(jié)晶后甾醇的純度/%。

1.3.5 紅松籽油甾醇的鑒定分析

1.3.5.1 紅松籽油甾醇的紫外-可見(jiàn)光譜掃描分析

取少量紅松籽油甾醇，用甲醇溶解，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.5.2 紅松籽油甾醇的紅外光譜掃描分析

稱(chēng)量干燥后的紅松籽油甾醇樣品1 mg，稱(chēng)取烘干后的KBr 100 mg，研磨混合均勻后，壓片，采用紅外光譜透射法進(jìn)行掃描。

1.3.5.3 紅松籽油甾醇的GC-MS鑒定分析

樣品前處理方法參考彭麗霞等[17]的方法。GC條件：DB-5 ms柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為260 ℃；載氣為He，分流進(jìn)樣，分流比為30∶1；恒定流速1 mL/min，采用升溫程序，初始溫度230 ℃保持2 min；以2 ℃/min升至250 ℃，保持45 min。

MS條件：接口溫度280 ℃，溶劑延遲3 min，EI離子源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～500 amu。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 24.0、Excel 2010與Origin 2018軟件進(jìn)行圖表繪制及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.1.1 大孔樹(shù)脂型號(hào)對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

根據(jù)極性不同選取了NKA-9(極性)、NKA-Ⅱ(極性)、AB-8(弱極性)、D-101(非極性)、S-8(非極性)5種大孔樹(shù)脂純化紅松籽油甾醇，其純化效果如表1所示。AB-8和D-101樹(shù)脂的吸附能力較強(qiáng)，NKA-9的吸附效果最差，D-101樹(shù)脂的解吸率顯著低于AB-8(P<0.05)。張冬陽(yáng)等[18]利用AB-8、D-101、DA-201樹(shù)脂純化薏米中β-谷甾醇，發(fā)現(xiàn)AB-8樹(shù)脂對(duì)β-谷甾醇的純化具有顯著效果，大孔樹(shù)脂的吸附與解吸能力與其本身的極性、比表面積和孔隙結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此選擇AB-8樹(shù)脂純化紅松籽油甾醇。

表1 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸效果

2.1.2 靜態(tài)吸附時(shí)間與甾醇濃度對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

吸附時(shí)間與甾醇濃度對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響結(jié)果如圖1所示。AB-8樹(shù)脂在吸附紅松籽油甾醇過(guò)程中，吸附率隨時(shí)間的增加呈先升高后平緩的趨勢(shì)，在0～3 h范圍內(nèi)吸附率快速上升，3 h后樹(shù)脂吸附趨于平衡，表明AB-8樹(shù)脂可快速吸附紅松籽油甾醇，3 h內(nèi)達(dá)到吸附基本達(dá)到飽和，故選擇吸附時(shí)間為3 h。

紅松籽油甾醇溶液因含有較多色素和脂肪酸，上樣質(zhì)量濃度越高雜質(zhì)含量越大，溶液黏度增大，會(huì)爭(zhēng)奪AB-8樹(shù)脂中的活性位點(diǎn)，增加樹(shù)脂對(duì)雜質(zhì)的吸附效果，占據(jù)樹(shù)脂空隙，導(dǎo)致甾醇吸附率降低。當(dāng)紅松籽油甾醇上樣質(zhì)量濃度較低時(shí)所含甾醇含量較小，吸附動(dòng)力小，吸附率低。合適的上樣質(zhì)量濃度使紅松籽油甾醇與樹(shù)脂充分接觸，提高樹(shù)脂利用率，故選擇紅松籽油甾醇的上樣質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。

注：圖中小寫(xiě)字母的不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。圖1 吸附時(shí)間與甾醇濃度對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.1.3 靜態(tài)解吸時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

解吸時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響結(jié)果如圖2所示。解吸是為了將吸附在樹(shù)脂中的紅松籽油甾醇分離出來(lái)，而解吸液是一種更易與大孔樹(shù)脂相結(jié)合的物質(zhì)，可以減弱樹(shù)脂與紅松籽油甾醇的相互作用力，使紅松籽油甾醇更易釋放出來(lái)。在0～4 h范圍內(nèi)，紅松籽油甾醇的解吸率快速上升，4 h后達(dá)到平衡，此后解吸率變化趨于平穩(wěn)，因此選擇解吸時(shí)間為4 h。

乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～80%范圍內(nèi)，解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，大孔樹(shù)脂遵循相似相溶原則，AB-8樹(shù)脂屬于弱極性樹(shù)脂，樹(shù)脂的吸附性與范德華力和氫鍵有關(guān)，極性越相似范德華力越大[19]，乙醇的體積分?jǐn)?shù)越小，極性越大，不利于紅松籽油甾醇的解吸，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，極性變?nèi)酰咏麬B-8樹(shù)脂的極性，故解吸效果越強(qiáng)[20]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)，醇溶性雜質(zhì)被解吸出來(lái)，導(dǎo)致紅松籽油甾醇的解吸率下降，故選擇體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液解吸紅松籽油甾醇。

圖2 解吸時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.2 動(dòng)態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.2.1 吸附流速與解吸流速對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

吸附流速與解吸流速對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響，結(jié)果如圖3。合適的吸附流速節(jié)省時(shí)間同時(shí)可提高效率，吸附流速為2 mL/min時(shí)吸附率最大(P<0.05)，為(88.44±3.52)%，吸附流速較慢時(shí)，紅松籽油甾醇可與樹(shù)脂充分接觸，擴(kuò)散至樹(shù)脂孔隙內(nèi)部，但試驗(yàn)周期長(zhǎng)效率低，吸附流速快，樹(shù)脂與紅松籽油甾醇作用時(shí)間短，導(dǎo)致紅松籽油甾醇未被吸附便已泄漏[21]，因此選擇吸附流速為2 mL/min。

圖3 吸附流速與解吸流速對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

解吸流速越快，導(dǎo)致乙醇溶液未充分?jǐn)U散至樹(shù)脂內(nèi)部便已流出，并未溶解出紅松籽油甾醇，故解吸效果差，而解吸流速較慢時(shí)，醇溶性雜質(zhì)被帶出，純化效果不佳，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)[22]，因此選擇解吸流速為2 mL/min。

2.2.2 紅松籽油甾醇上樣量對(duì)純化效果的影響

甾醇上樣質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，以2 mL/min流速收集流出液，每5 mL 為一個(gè)流分，測(cè)定每個(gè)流分中的甾醇含量，以泄漏點(diǎn)為指標(biāo)，泄漏曲線如圖4所示。以流出液中紅松籽油甾醇的質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液中紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度的十分之一為泄漏點(diǎn)[23]，當(dāng)流出液中甾醇的濃度達(dá)到泄漏點(diǎn)時(shí)，表明樹(shù)脂已吸附飽和。第6個(gè)流分中紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度為0.023 mg/mL，即上樣量為30 mL時(shí)，紅松籽油甾醇已達(dá)到泄漏點(diǎn)，上樣量較小，樹(shù)脂不能充分利用，未吸附紅松籽油甾醇的樹(shù)脂活性位點(diǎn)易被雜質(zhì)占據(jù)，導(dǎo)致純化效果下降[24]；上樣量較大，樹(shù)脂吸附飽和后造成原液中紅松籽油甾醇大量流失，故選擇30 mL為紅松籽油甾醇的最佳上樣量。

圖4 泄漏曲線

2.2.3 解吸液體積對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

取2.00 g吸附飽和的樹(shù)脂，用80%乙醇溶液以2 mL/min解吸，每5 mL為一個(gè)流分，測(cè)定每個(gè)流分中紅松籽油甾醇含量，解吸液體積對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響見(jiàn)圖5。解吸液體積較小不能完全洗脫出紅松籽油甾醇，解吸液體積較大，溶劑消耗大，且后期溶劑去除困難。第14個(gè)流分中紅松籽油甾醇基本已經(jīng)全部解吸出來(lái)，之后隨著乙醇溶液的增加，紅松籽油甾醇含量不再變化，最終紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度降至0.01 mg/mL并趨于平穩(wěn)，故選擇解吸液體積為70 mL。

本研究中，大孔樹(shù)脂純化紅松籽油甾醇的最佳工藝：選擇AB-8樹(shù)脂、上樣質(zhì)量濃度0.2 mg/mL，上樣量30 mL，吸附流速2 mL/min，吸附時(shí)間3 h，解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，乙醇體積70 mL，解吸流速2 mL/min，解吸時(shí)間4 h，此條件下紅松籽油甾醇純度為(45.32±2.13)%。

圖5 洗脫曲線

2.3 磁場(chǎng)輔助溶劑結(jié)晶二次純化紅松籽油甾醇的研究

2.3.1 結(jié)晶溶劑對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

稱(chēng)取紅松籽油甾醇，加入不同結(jié)晶溶劑，輕微加熱直至甾醇全部溶解，冷卻至室溫，置于磁場(chǎng)中結(jié)晶，當(dāng)溶液中甾醇含量不再變化時(shí)表明結(jié)晶結(jié)束，養(yǎng)晶溫度-7 ℃，養(yǎng)晶時(shí)間5 h條件下，結(jié)晶溶劑對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響如圖6、圖7所示。利用高斯計(jì)測(cè)定磁場(chǎng)強(qiáng)度為0.3 T，磁場(chǎng)可促進(jìn)晶體的成核速率，加快晶體生長(zhǎng)速度。純度較高的植物甾醇為白色晶體，粗甾醇因含有色素及脂肪酸，使其黏度較大為黃色膏狀體，不宜使用活性炭脫色，經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的紅松籽油甾醇呈淡黃色，故使用有機(jī)溶劑繼續(xù)來(lái)萃取色素和脂肪酸。

圖6 不同溶劑中紅松籽油甾醇結(jié)晶效果圖

注：純度之間差異顯著性(P<0.05)用不同小寫(xiě)字母表示；結(jié)晶率之間差異顯著性(P<0.05)用不同大寫(xiě)字母表示；下同。圖7 結(jié)晶溶劑對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

不同溶劑中紅松籽油甾醇結(jié)晶效果如圖6所示，紅松籽油甾醇在無(wú)水乙醇中結(jié)晶顆粒顏色為白色，而在其他4種溶劑中結(jié)晶顆粒表面泛黃，在異丙醇中結(jié)晶顆粒粗大，在正己烷中呈絮狀，在無(wú)水乙醇和丙酮中結(jié)晶顆粒較為均勻，且結(jié)晶速度較快，在甲醇中結(jié)晶顆粒細(xì)小而輕薄。由圖7可知異丙醇和無(wú)水乙醇作為結(jié)晶溶劑時(shí)，紅松籽油甾醇的純度差異不顯著，但異丙醇的結(jié)晶率較低，而無(wú)水乙醇和丙酮的結(jié)晶率較高，可能是植物甾醇在丙酮試劑中溶解度變化較大，析出晶體較多，但丙酮結(jié)晶出的甾醇純度較低，故選擇無(wú)水乙醇為結(jié)晶溶劑。以無(wú)水乙醇為結(jié)晶溶劑，無(wú)磁場(chǎng)條件下紅松籽油甾醇結(jié)晶率為(30.39±0.54)%，純度為(54.25±2.13)%，對(duì)比表明，磁場(chǎng)輔助溶劑結(jié)晶純化紅松籽油甾醇可使其純度提高20.86%。

2.3.2 料液比對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

以無(wú)水乙醇為結(jié)晶溶劑，養(yǎng)晶溫度-7 ℃，養(yǎng)晶時(shí)間5 h時(shí)，料液比對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響如圖8所示。

圖8 料液比對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

當(dāng)料液比為1∶10 時(shí)紅松籽油甾醇的純度和結(jié)晶率均最大(P<0.05)，在結(jié)晶體系中，料液比越大過(guò)飽和度越小，晶核更易于形成，晶體依附晶核生長(zhǎng)，形態(tài)較好且純度更高，但因晶體生長(zhǎng)緩慢，甾醇結(jié)晶率較低。料液比越小，飽和度越大，體系傳質(zhì)阻力增大，晶體不規(guī)則生長(zhǎng)且速率加快，結(jié)晶率升高，但不規(guī)則生長(zhǎng)會(huì)包裹雜質(zhì)導(dǎo)致純度降低[25]。

2.3.3 養(yǎng)晶溫度對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

以無(wú)水乙醇為結(jié)晶溶劑，料液比1∶10 ，養(yǎng)晶時(shí)間5 h時(shí)，養(yǎng)晶溫度對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響如圖9所示。

養(yǎng)晶溫度為5 ℃時(shí)，紅松籽油甾醇的純度(80.48±2.10)%及結(jié)晶率(35.00±0.90)%均最大(P<0.05)，溫度為-18 ℃，雜質(zhì)析出較多，純度為(53.65±1.52)%。田燕等[26]研究表明0 ℃左右各種甾醇均會(huì)結(jié)晶析出，而室溫或高于室溫，高純度的谷甾醇結(jié)晶析出，但得率低。彭超等[27]均在5 ℃條件下結(jié)晶，植物甾醇純度為97.72%。

圖9 養(yǎng)晶溫度對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.3.4 養(yǎng)晶時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

以無(wú)水乙醇為結(jié)晶溶劑，料液比1∶10，養(yǎng)晶溫度5 ℃，養(yǎng)晶時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響如圖10所示。

紅松籽油甾醇的結(jié)晶率和純度都隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后下降的趨勢(shì)，養(yǎng)晶時(shí)間4 h純度(83.12±2.10)%和結(jié)晶率(39.00±0.51)%最大(P<0.05)，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)，晶核表面附著雜質(zhì)越多，純度明顯降低，田燕等[26]認(rèn)為養(yǎng)晶時(shí)間長(zhǎng)會(huì)降低生產(chǎn)效率，不利于實(shí)際生產(chǎn)，因此選擇養(yǎng)晶時(shí)間為4 h。

因此，利用磁場(chǎng)輔助溶劑結(jié)晶二次純化紅松籽油甾醇的最佳工藝為：磁場(chǎng)強(qiáng)度0.3 T，無(wú)水乙醇為結(jié)晶溶劑，料液比1∶10 ，養(yǎng)晶溫度5 ℃，養(yǎng)晶時(shí)間4 h。此條件下紅松籽油甾醇純度為(83.12±3.24)%。

圖10 養(yǎng)晶時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.4 紅松籽油甾醇的結(jié)構(gòu)鑒定

2.4.1 紅松籽油甾醇紫外-可見(jiàn)光譜掃描分析

利用甲醇將粗甾醇和二次純化后的紅松籽油甾醇溶解，于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，所得圖譜如圖11所示，紅松籽油甾醇純化物的甲醇溶液在211 nm處有1個(gè)強(qiáng)吸收峰，粗提物在212 nm處有1個(gè)強(qiáng)吸收峰，符合植物甾醇的特征吸收峰[28]，粗提物可能含有雜質(zhì)，使曲線有拖尾現(xiàn)象。

圖11 紅松籽油甾醇的紫外吸收曲線

2.4.2 純化后紅松籽油甾醇的紅外光譜掃描分析

植物甾醇是以環(huán)戊烷多氫菲(3個(gè)環(huán)己烷和1個(gè)環(huán)戊烷稠合而成)為骨架及3個(gè)側(cè)鏈而構(gòu)成，R1和R2一般為甲基，R3一般為多碳鏈構(gòu)成，且C3位為羥基。二次純化后的紅松籽油甾醇的紅外光譜掃描結(jié)果如圖12所示，3 341 cm-1處有譜帶較寬的羥基(—OH)振動(dòng)峰，2 941 cm-1為甲基(—CH3)振動(dòng)峰，2 868 cm-1為亞甲基(—CH2)振動(dòng)峰，1 464 cm-1為甲基或亞甲基的不對(duì)稱(chēng)變形振動(dòng)峰，1 376 cm-1為甲基的對(duì)稱(chēng)變形振動(dòng)峰，1 058 cm-1為羥基鍵的變形振動(dòng)峰，960 cm-1反式二取代烯烴的彎曲振動(dòng)峰，839 cm-1為三取代烯烴的彎曲振動(dòng)峰，800 cm-1為C—C單鍵伸縮振動(dòng)峰，均符合植物甾醇的特征吸收峰[29]，而在1 750～1 725 cm-1處無(wú)明顯的酯基振動(dòng)峰，表明與脂肪酸相連的甾醇已完全游離出來(lái)。

圖12 紅松籽油甾醇的紅外分析圖譜

2.4.3 純化后紅松籽油甾醇種類(lèi)及含量分析

以膽固醇為內(nèi)標(biāo)物，采用GC-MS對(duì)紅松籽油甾醇種類(lèi)及含量進(jìn)行分析，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算甾醇含量。結(jié)果如圖13所示。保留時(shí)間為28.19、32.75、39.43、40.99 min的峰分別為芝麻素、菜油甾醇、β-谷甾醇、16-α-羥基孕甾烯醇酮，其含量分別為(7.13±0.15)、(33.37±0.13)、(153.12±0.24)、(53.38±0.16)mg/100 g，紅松籽油甾醇總量為186.49 mg/100 g，且以β-谷甾醇為主。朱雪梅等[30]測(cè)得松籽油甾醇含量為141.64 mg/100 g。徐鑫等[31]測(cè)得松籽油甾醇含量為207.66 mg/100 g，菜油甾醇和谷甾醇分別為40.265、167.397 mg/100 g。

注：1～5分別表示膽固醇、芝麻素、菜油甾醇、β-谷甾醇、16-α-羥基孕甾烯醇酮。圖13 紅松籽油甾醇的GC-MS總離子圖

3 結(jié)論

采用5種大孔樹(shù)脂對(duì)紅松籽油甾醇進(jìn)行初步純化，結(jié)果表明AB-8樹(shù)脂更適用于紅松籽油甾醇的純化，在本實(shí)驗(yàn)最佳純化工藝下，紅松籽油甾醇純度為(45.32±2.13)%。利用磁場(chǎng)輔助溶劑結(jié)晶法進(jìn)行二次純化后，紅松籽油甾醇的純度為(83.12±3.24)%。紅松籽油甾醇經(jīng)紫外-可見(jiàn)光譜掃描，在210 nm波長(zhǎng)左右處有最大吸收峰，利用紅外光譜掃描，在3 341、2 941、2 868、1 376、1 058、960、839、800 cm-1處出現(xiàn)了植物甾醇的特征吸收峰，經(jīng)GC-MS鑒定出紅松籽油中的2種植物甾醇，分別為β-谷甾醇和菜油甾醇，且β-谷甾醇占甾醇總量的80%以上。結(jié)果表明，采用大孔樹(shù)脂聯(lián)合磁場(chǎng)輔助溶劑結(jié)晶法可以有效的對(duì)紅松籽油甾醇進(jìn)行純化，今后可進(jìn)一步研究純化后紅松籽油甾醇的功能性質(zhì)以及磁場(chǎng)對(duì)結(jié)晶效果影響機(jī)理。