糖基化改性對英國紅蕓豆抗氧化肽抗氧化活性的影響

趙玉濱， 穆秋霞， 董憲慧， 鄭喜群，王 坤， 崔素萍

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319) (國家雜糧工程技術研究中心2，大慶 163319) (糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心3，大慶 163319)

抗氧化肽是一類生物體內源或由動植物蛋白質水解后生成的，具有清除自由基、抑制脂質過氧化作用的活性寡肽或多肽。抗氧化肽作為一種天然抗氧化劑，其結構相對簡單，具有易吸收、穩定性好、無免疫反應性等優點，在食品和醫療保健品領域備受關注[1]，可作為食品添加劑減緩食品在儲藏過程中的氧化反應[2]。喬曉林等[3]通過酶解小麥面筋蛋白，利用超濾膜對小麥面筋蛋白酶解物進一步分離、純化，獲得了具有很強的體外抗氧化活性多肽組分。

目前，抗氧化肽的抗氧化活性仍然遠不如人工合成的抗氧化劑活性高，因此，提高天然抗氧化肽活性的改性方法是目前的研究熱點之一[4]。常用的改性方法有化學改性、酶法改性和基因工程改性等。化學改性方法包括糖基化、磷酸化、酰化、脫酰胺、共價交聯、水解及氧化等法；其中糖基化改性是一種非酶促褐變反應，是基于美拉德反應機理的羰氨縮合反應，該過程不需任何化學催化劑參與即可完成[5]，糖基化改性有助于增加抗氧化能力和抗菌能力等[6]。抗氧化肽通過糖基化改性后抗氧化活性會得到大幅提升，這些研究使人們對抗氧化肽的生物活性有了新的認識。研究表明，糖基化改性不但可以有效提高天然蛋白質及肽的抗氧化活性，而且具有低毒、高效等優點[7]。林巍等[8]利用 3 種糖與紫花蕓豆肽發生糖基化反應，反應產物的 ATBS 自由基清除率及 DPPH 自由基清除率也顯著增加。但目前有關糖基化改性反應溫度過高(高于 100 ℃)，易生成有害物質，杜卿卿等[9]利用木糖和半胱氨酸在 110 ℃ 下發生糖基化反應，產物中含有呋喃、雜環胺等有害物質。邵艷紅[10]在對牛血清蛋白進行糖基化改性時也發現改性產物中由類黑精、果糖胺等有害物質的生成；所以如何更好地利用濕法糖基化改性在提高目標物抗氧化活性的同時，又能保證產生較少的有害物質是需要進一步研究的課題。

英國紅蕓豆是豆科菜豆屬的一種雜糧作物，蕓豆品種最早引自英國，外觀呈紫紅色，腎型，該品種是近年來在國內外市場非常暢銷的蕓豆品種[11]。我國主要在東北、內蒙古、陜西、河北等地區種植[12]，其中黑龍江省是英國紅蕓豆的主要產區，占全年英國紅蕓豆出口總量的1/4左右[13]。韓晶等[14]在對黑龍江 6 個主要種植品種的蕓豆進行營養素評價研究發現，在對En、紫荊花、白沙克、日本紅、西班牙白、英國紅等 6 個品種進行蛋白質含量測定后得到結論，英國紅蕓豆的蛋白質質量分數達到 22.03%，是6個蕓豆品種中蛋白質含量最高的。

本課題組前期制備了英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽，為了進一步提高其抗氧化活性，擬對其進行糖基化改性，同時為了減少糖基化改性產物中有害物質丙烯酰胺的生成，將改性溫度控制在 90 ℃。以抗氧化肽凍干粉為原料，運用濕法糖基化改性的方法，使蕓豆抗氧化肽與木糖進行糖基化反應，以羥自由基清除率和丙烯酰胺生成量為指標，確定糖基化改性最佳反應條件；然后分析糖基化改性產物的抗氧化情況、褐變程度和接枝度；最后通過熒光光譜法、紫外光譜法、傅里葉紅外光譜法、SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳和粒徑分布測定，對糖基化改性產物進行分析，以期為英國紅蕓豆抗氧化肽糖基化改性產物的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

英國紅蕓豆；堿性蛋白酶(2709，2.0×105U/g)、還原型谷胱甘肽，為生化試劑。木糖、果糖、葡萄糖等其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

日立 U-2910 型紫外分光光度計，Chrwasta Epsilon 2-4 D 型冷凍干燥機， CF16 RN 型超速離心機，RF-6000 型熒光光譜儀，Tensor 27 型傅里葉變換紅外光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 英國紅蕓豆抗氧化肽的制備

參照參考文獻[15]的方法，利用堿性蛋白酶制備英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽，真空冷凍干燥備用。

1.3.2 抗氧化肽糖基化改性最佳還原糖的確定

分別稱取 0.1 g糖(木糖、果糖、葡萄糖)和 0.1 g英國紅蕓豆抗氧化肽，加入 10 mL水充分溶解，調節 pH 7，進行 10 min 紫外線殺菌。反應溫度為 90 ℃，反應時間 4 h，以相同濃度的VC溶液作對照，以糖基化產物羥自由基(·OH)清除率為指標，確定最佳還原糖，羥自由基清除率的測定方法見參照文獻[16]。

1.3.3 糖基化改性最佳反應條件的優化

丙烯酰胺測定方法見參照文獻[17]，丙烯酰胺標準曲線線性回歸方程為：y=-6×10-5c+0.316 9，回歸系數R2=0.991 6。其中c為丙烯酰胺濃度，y為吸光度(A)。將 1.3.2 中確定的最佳還原糖用于后續糖基化改性，改性溫度控制在 90 ℃，分別對 pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，反應時間(2、3、4、5、6 h)和糖肽比為(0.5∶1，1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5 ∶1、1∶1.5、1∶2.5)等進行單因素實驗，以糖基化產物的羥基自由基清除率和丙烯酰胺含量為指標，確定正交實驗因素的最優水平后，進行正交實驗和驗證實驗，最終確定糖基化改性的最優反應條件。

1.3.4 抗氧化肽糖基化改性前后體外抗氧化活性分析

參照參考文獻[16]的方法對糖基化產物進行羥自由基清除率、DPPH 自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及還原力的分析。

1.3.5 糖基化改性褐變程度分析

褐變程度測定方法見文獻[18]，稍有改動，分別取2.0 mL質量濃度為 10 mg/mL 的糖基化反應前后的溶液加入 8.0 mL 稀釋液(質量分數10%SDS 及 0.05 mol/L 硼砂)，在 420 nm 下測量糖基化反應前后的吸光度，以稀釋液作空白。

1.3.6 糖基化改性接枝度的測定

參照參考文獻[19]的方法，用游離氨基酸含量表征產物的接枝度(DG%)。測定時將糖基化改性前后的溶液分別稀釋至 2 mg/mL，運用 OPA 法測定接枝度(DG)。

1.3.7 熒光光譜分析

利用 pH 7.2 的磷酸緩沖液，分別配制濃度均為 5 mg/mL 的蕓豆蛋白抗氧化肽和糖基化反應產物的待測液。取 20 μL ANS溶液(8 mmol/L)加到 4 mL 待測液中混合均勻，在激發波長為 347 nm 處激發，激發帶寬 5 nm，掃描速率為 100 nm/min，迅速進行 365～550 nm 波長掃描，以未加樣品的磷酸鹽緩沖液為空白。

1.3.8 紫外-可見光譜分析

將質量濃度為 2 mg/mL 的英國紅蕓豆抗氧化肽和糖基化反應產物用紫外可見分光光度計從 245 nm 掃描到 400 nm，比較反應前后樣品的紫外吸收特性的變化。

1.3.9 傅里葉中紅外光譜分析

將 2 mg 糖基化改性前后的凍干樣品分別與 200 mg溴化鉀粉末充分混合研磨，在 10～12 T 壓力下將混合粉末壓制成固體薄膜，進行全波段掃描，測量范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.10 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

實驗使用 5% 的丙烯酰胺濃縮膠和質量分數16.5%丙烯酰胺分離凝膠進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，制備 pH 8.0 的樣品緩沖液。將 200 μL 濃度為 40 mg/mL 樣品溶液與 200 μL 的 1×SDS 負載緩沖液混合，置于沸水中 5 min。冷卻后，將 Marker、蕓豆抗氧化肽、糖基化改性產物以及英國紅蕓豆蛋白溶液樣品分別取 18 μL 注入斑點井。將濃縮凝膠中的電壓設置為 60 V，分離凝膠電壓設置為 110 V 進行電泳。當溴酚藍離凝膠底部約 1 cm 時，電泳終止，通過凝膠成像儀進行觀察。

1.3.11 粒徑分布測定

分別用去離子水配制 1 mg/mL 的抗氧化肽和糖基化改性產物溶液，采用 ZEN-3700 型馬爾文激光粒度儀對溶液的平均粒徑進行測定。實驗時測定時間設為 120 s，選用 DTS0012 皿在室溫條件(25 ℃)下重復測定 20 次。

1.3.12 數據統計分析

用 Origin 8.5 和 SPSS 26.0 軟件進行統計和方差分析(ANOVA)，用 Duncan 法進行差異顯著性分析，所有實驗均做3次重復，取平均值。

2 結果與分析

2.1 最佳還原糖的確定

由表1可見，木糖與抗氧化肽糖基化反應產物的羥自由基清除率為 66.4%，顯著高于(P<0.05)葡萄糖和果糖，但顯著低于同等質量濃度(10 mg/mL)下VC的活性，結果與孫煒煒等[20]在進行賴氨酸糖基化改性研究的結果一致。由于木糖是一種五碳糖，與葡萄糖和果糖相比，更容易發生糖基化反應。因此，選擇木糖作為英國紅蕓豆抗氧化肽糖基化改性的目標糖。

表1 單糖種類對糖基化產物羥自由基清除率的影響

表2 pH 對糖基化反應產物羥自由基清除率和丙烯酰胺含量的影響

表3 反應時間對糖基化反應產物羥自由基清除率和丙烯酰胺含量的影響

表4 糖肽比對糖基化反應產物羥自由基清除率和丙烯酰胺含量的影響

2.2 糖基化改性條件優化

2.2.1 最佳 pH 的確定

如表2所示，當pH 7.0時，糖基化反應產物的羥自由基清除率最高為 71.1%，且差異顯著(P<0.05)，但顯著低于VC的清除能力。堿性條件下生成的丙烯酰胺量顯著低于酸性條件下的生成量，當 pH 為8.0時，丙烯酰胺含量均最低。由于pH為8.0時反應產物的羥自由基清除能力顯著低于pH 7.0，不利于提高改性產物的抗氧化活性。綜合考慮抗氧化活性及丙烯酰胺生成量，初步確定pH 7.0為糖基化改性最佳pH。郭浩等[21]在研究葡萄糖糖基化改性玉米醇溶蛋白膜的物化性質時，選用的最佳pH也是7.0。

2.2.2 最佳反應時間的確定

如表3所示，反應時間為4 h時，反應產物的羥自由基清除率最高為69.3%，且差異顯著(P<0.05)，但顯著低于VC的清除率。隨著反應時間的延長，丙烯酰胺含量顯著增加，反應時間為2、3 h時，丙烯酰胺含量較低。綜合考慮改性產物的抗氧化活性及丙烯酰胺的生成量，確定糖基化改性最佳反應時間為4 h，這與趙玉濱等[22]在研究糖基化改性對酪蛋白酶解產物抗氧化性影響時所選的最佳反應時間一致。

2.2.3 最佳糖肽比的確定

如表4所示，在糖肽比為 1∶1 時，反應產物的羥自由基清除率為 72.8%，顯著(P<0.05)高于其他各組，但顯著低于 VC的清除率。在糖肽比為 1∶1.5 和 1.5∶1 時，羥自由基清除率也較高，說明糖肽比例越接近于 1∶1，反應產物的羥自由基清除率就會越高，相應的抗氧化性也會越強。當糖肽比為 1∶1 時，丙烯酰胺含量最低，為 279.50 μg/L，且差異顯著(P<0.05)；在糖肽比為 1.5∶1 時的丙烯酰胺生成量顯著低于 1∶1.5 的丙烯酰胺含量。可見，反應體系中越丙烯酰胺的含量隨著木糖的含量增加而增加。當肽糖比例控制在 1∶1 時，反應產物的羥自由基清除率最大且丙烯酰胺含量最低。張亞婷等[23]在研究復合物改性大豆分離蛋白功能性質時，也利用了糖基化改性提高抗氧化性，得出的最佳糖肽比也為 1∶1。

2.2.4 正交實驗及結果

在單因素實驗的基礎上，設計正交實驗，正交實驗因素水平見表 5，實驗結果見表 6。K(k) 代表羥基自由基清除率，K’(k’)代表丙烯酰胺含量。在糖基化溫度為 90 ℃，影響改性產物羥自由基清除率的主次因素為：A>C>B，pH 為主要影響因素；影響丙烯酰胺生成量的主次因素為：B>C>A，時間為主要因素。羥自由基清除率和丙烯酰胺生成量的最優水平分別為A2B1C1(pH 7、反應時間 3.5 h、糖肽比 1∶1.25)和A2B2C2(pH 7、反應時間 4 h、糖肽比 1∶1)，反應溫度均為 90 ℃。

表5 正交實驗因素水平表

表6 正交實驗結果分析

續表6

2.2.5 驗證實驗

將2個最優水平組合設計驗證實驗，進行3次平行實驗。驗證結果表明，A2B1C1的羥自由基清除率為 67.5%，丙烯酰胺生成量為342.66 μg/L；A2B2C2的羥自由基清除率為 77.2%，丙烯酰胺生成量為 359.23 μg/L，我國行業標準要求一般食物或食物原料中最大檢測限為 0.2 mg/kg(干基含量)，在動物可食性組織中的檢測限為 0.05 pg/g，本實驗研究結果與我國丙烯酰胺行業檢出標準接近。其中A2B2C2條件下制備糖基化改性產物的羥自由基清除率顯著高于A2B1C1；兩種條件改性產物中丙烯酰胺生成量較低且無顯著性差異，所以A2B2C2為英國紅蕓豆抗氧化肽糖基化改性的最佳反應條件，即 pH 7、時間 4 h、糖肽比例 1∶1，反應溫度為90 ℃。

糖基化改性可以顯著提高英國紅蕓豆抗氧化肽的抗氧化活性，最優的糖基化改性條件為：反應體系 10 mg/mL、反應溫度 90 ℃、pH 7、反應時間 4 h、反應體系糖肽比為 1∶1。

2.3 糖基化改性前后體外抗氧化活性分析

由表7可見，與改性前相比，改性后羥基自由基清除率、DPPH 自由基清除率、還原力分別提高了80.9%、75.1% 及 135.7%，但均顯著低于同等濃度 VC的抗氧化能力；改性前后與亞鐵離子螯合能力均顯著高于 VC，這與 Li等[24]的研究結果一致，改性后的蕓豆抗氧化肽與亞鐵離子的螯合能力提高到了 60.4%。抗氧化劑的抗氧化機理有自由基清除劑、單線態氧淬滅劑、氫過氧化物轉化劑、金屬螯合劑等。劉祥等[25]在研究糖基化對玉米蛋白粉雙酶水解產物抗氧化活性的影響時發現，糖基化產物羥基自由基清除率、DPPH 自由基清除率、還原力、與亞鐵離子螯合能力均得到顯著提高。江連洲等[26]在研究葡聚糖糖基化處理對綠豆蛋白抗氧化性影響研究時也發現，綠豆蛋白還原力、DPPH 自由基清除能力、超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力都有顯著提高。可見，糖基化改性是提高英國紅蕓豆抗氧肽組分抗氧化性的一種非常高效的方法。

表7 糖基化改性前后抗氧化活性的變化

2.4 褐變程度分析

糖基化產物褐變程度及接枝度見表8。通過糖基化改性反應，改性產物的褐變程度達到了0.52；改性后產物的接枝度為 39%，改性前接枝度 2%，說明抗氧化肽中氨基酸與木糖進行了充分的羰氨縮合反應，生成了分子量較大的物質如類黑色素類，導致吸光度上升，反映出褐變程度加深。劉郁琪等[22]在研究酪蛋白與可溶性大豆多糖糖基化產物制備時，接枝度也達到 20.7%，與本研究相符。反應后的產物接枝度增大，說明反應體系游離氨基含量減少。

表8 糖基化改性前后褐變程度及接枝度改變情況

2.5 熒光光譜分析

如圖1所示，熒光物質是糖基化反應進行到末期階段生成的產物，是糖基化改性反應的一個顯著特征[27]。伴隨糖基化改性的發生，反應產物中生成大量的有色物質[28]。反應前的抗氧化肽最大吸收峰在413 nm附近，最大熒光強度為3 761，而改性后的反應產物最大吸收峰在419 nm附近,最大熒光吸收強度達到了12 806.6，熒光吸收特性顯著增強，這符合糖基化產物所具有的熒光特性。有研究報道在葡萄糖和賴氨酸體系中熒光物質的積累是由于還原物質與胺之間不可逆轉的反應[29]，大多數熒光化合物的形成是與存在酪蛋白以及褐變的發生相關聯的，證明了蕓豆蛋白肽和木糖發生了共價接枝反應。

圖1 熒光吸收光譜

2.6 紫外吸收光譜分析

如圖2所示，糖基化改性產物紫外光吸收的最大吸收峰都出現在265～275 nm內，在此范圍內有較大的吸收峰的應該是抗氧化組分中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸所致，若此3種氨基酸發生反應，反應產物在265～275 nm處紫外吸收強度應該降低，但是糖基化產物的吸收峰強度較蕓豆抗氧化肽相比反而明顯增強，并且反應產物的最大吸收峰向左偏移發生了藍移現象，這可能是由于糖基化改性反應過程中，產生了較多的具有紫外光吸收特性的物質[24]，所以導致糖基化改性產物在此處紫外吸收強度增大。

圖2 紫外吸收光譜

2.7 傅里葉中紅外光譜分析

圖3 傅里葉中紅外光譜

2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

如圖4所示，第1泳道的蕓豆蛋白抗氧化肽未出現明顯條帶，說明蕓豆蛋白經堿性蛋白酶酶解后生成的多肽種類較多，多肽的分子量大小大多集中在20 ku處左右，與最右側第 3 泳道的蕓豆蛋白相比，分子量明顯減小，表明堿性蛋白酶對蕓豆蛋白酶解比較徹底。分子量明顯經過糖基化改性反應以后生成第2泳道的糖基化改性產物顏色變淺，可能是蕓豆抗氧化肽經過糖基化反應后，自由氨基減少，染色劑考馬斯亮藍與糖基化改性產物反應位點減少，進而減少了考馬斯亮藍與多肽的結合，導致考馬斯亮藍染色時顏色變淺，這也間接證明了經過糖基化改性生成了新的物質[32]。

注：M為蛋白肽Marker；1為蕓豆抗氧化肽；2為糖基化改性產物；3為蕓豆蛋白。圖4 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.9 粒徑分布測定

如圖5所示，反應前抗氧化肽的粒徑分布在400～1 100 nm之間，經過糖基化改性生成的糖基化改性性產物的粒徑分布在100～300 nm之間，糖基化改性產物的粒徑減小，這與于楓[33]在研究米糠蛋白糖基化改性產物粒徑的變化趨勢一致；粒徑減小的原因可能是蕓豆抗氧化肽經過糖基化改性反應后，由于木糖的接入，使得抗氧化肽的結構發生了變化，抗氧化肽溶液中原有的聚集顆粒被破壞分散，形成粒徑更小的均一體系。粒徑對抗氧化肽乳液的穩定性十分關鍵，較小的粒徑導致界面張力下降，提高了乳液抵抗失穩的能力，同時粒徑越小乳液越不容易分層，相應的乳液中的聚集現象越少，這增加了分子內部疏水基團發揮作用的機會，表明蕓豆抗氧化肽糖基化改性產物作為乳化劑具有很好的應用潛力。

圖5 粒徑分析圖

3 結論