鋅轉運體ZIP13 在小鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用

江天鐸，程欣欣，徐哲龍

（天津醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，天津 300070）

肝臟缺血再灌注損傷常見于肝臟外科手術過程中，如肝移植、肝切除等。肝臟缺血再灌注損傷是缺血肝組織在恢復血液供應后，肝損傷反而進一步加重的現象，會引起一系列生理生化改變，包括炎癥、氧化應激、內質網應激和細胞凋亡等[1-3]，但其具體發病和保護機制尚不清楚。

鋅是維持人體正常生理功能所必需的微量元素，在人體內參與300 余種酶的活化以及1 000 余種轉錄因子三維結構的穩定。研究表明，維持鋅離子的穩態有助于減輕腎、胃、肝、心等器官缺血再灌注損傷[4]。細胞鋅離子的穩態受離子通道、金屬硫蛋白及鋅轉運體的嚴格調控[5-6]。ZIP13 作為鋅轉運蛋白家族成員之一，在調控鋅離子穩態中起到重要的作用，它主要定位于高爾基體、內質網和其他細胞器內[7-8]。本研究組最新的研究結果證明，ZIP13 在小鼠心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用[9]，但ZIP13 在肝臟缺血再灌注損傷中的作用還尚不清楚。因此，本研究的目的是探討ZIP13 在肝臟缺血再灌注損傷中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6J 野生型雄性小鼠由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供[動物批號：SYXK-20190004，許可證號SCXK（京）2019-0010]。ZIP13 flox（ZIP13fl/fl）小鼠由南京大學-南京生物醫藥研究院提供。Alb-Cre 小鼠為常永生教授贈送。所有小鼠均在SPF 級動物房飼養繁殖。動物實驗方案獲得天津醫科大學實驗動物倫理委員會批準，并嚴格按照國家實驗動物管理及使用指南操作。

選取8 周齡雄性ZIP13fl/fl和ZIP13LKO小鼠，采用隨機數字表法將24 只小鼠分組如下：（1）假手術組（ZIP13fl/fl-Sham 組）、缺血1 h 再灌注12 h 組（ZIP13fl/fl+I1R12 組）和肝臟ZIP13 基因特異性敲除缺血1 h 再灌注12 h 組（ZIP13LKO+I1R12 組），每組小鼠各4 只。（2）ZIP13fl/fl-Sham 組、缺血1 h 再灌注24 h 組（ZIP13fl/fl+I1R24 組）和肝臟ZIP13 基因特異性敲除缺血1 h 再灌注24 h 組（ZIP13LKO+I1R24 組），每組小鼠各4 只。選取8 周齡雄性腺相關病毒（AAV）感染小鼠，采用隨機數字表法將24 只小鼠分組如下：（1）空載體感染假手術組（Vector-Sham 組）、空載體感染缺血1 h 再灌注12 h 組（Vector+I1R12 組）、ZIP13過表達載體感染缺血1 h 再灌注12 h 組（ZIP13OE+I1R12 組），每組小鼠各4 只。（2）Vector-Sham 組、空載體感染缺血1 h 再灌注24 h 組（Vector+I1R24組）、ZIP13 過表達載體感染缺血1 h 再灌注24 h 組（ZIP13OE+I1R24 組），每組小鼠各4 只。

1.1.2 實驗試劑 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和門冬氨酸氨基轉移酶（AST）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TUNEL 凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Caspase 9 抗體（10380-1-AP）、Caspase 3 抗體（19677-1-AP）、GRP78 抗體（11587-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；CHOP抗體（2895S）、抗-GAPDH 抗體（2118S）、Anti-rabbit IgG 抗體（7074S）均購自美國Cell Signaling Technology 公司；BCL-2 抗體（Sc-492）購自美國Santa Cruz 公司；Anti Mouse IgG 抗體（RS0001）購自美國ImmunoWay Biotechnology 公司；AAV 購自上海漢恒生物科技有限公司；改良蘇木素染色液購自北京雷根生物技術有限公司；伊紅染色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝臟特異性敲除ZIP13 轉基因小鼠的構建 首先將ZIP13fl/fl小鼠和Alb-Cre 小鼠雜交獲得F1 代，基因型為ZIP13fl/wt/Alb-Cre。F1 代小鼠成年后繼續與ZIP13 flox 小鼠雜交，通過提取鼠尾基因組進行基因型鑒定，即可得肝臟特異性表達Cre 的ZIP13 flox純合小鼠，基因型為ZIP13fl/fl/Alb-Cre（ZIP13LKO）。

1.2.2 肝臟特異性過表達ZIP13 轉基因小鼠的構建 將24 只4 周齡C57BL/6J 野生型雄性小鼠按照隨機數字表法根據1.1.1 實驗動物安排進行分組，通過尾靜脈向相應分組小鼠分別注射ZIP13 過表達腺病毒載體（ZIP13OE）和對照空載體（Vector），注射劑量為100 μL/只，4 周后取小鼠肝臟，通過Western 印跡檢測ZIP13 蛋白表達水平并進行后續實驗。

1.2.3 小鼠肝臟缺血再灌注模型的建立 按照1.1.1實驗動物分組，對相應動物建立缺血再灌注模型。動物術前12 h 禁食，不禁水。經2.5%三溴乙醇腹腔麻醉，腹部至劍突區剃毛，75%乙醇術區消毒，取上腹正中切口并迅速打開腹腔。充分暴露第一肝門，小心分離出肝左葉和肝中葉，并游離出門靜脈和肝動脈，用顯微血管夾夾閉，使得肝左葉和肝中葉缺血，以實現70%的肝組織缺血。臨時關腹，并用動物體溫維持儀對小鼠體溫進行監控，保持小鼠體溫恒定。小鼠肝臟均接受1 h 缺血，根據不同分組需要分別再灌注12 h 或者24 h。假手術組僅開腹、游離血管及關腹等操作，不進行脈管夾閉。

1.2.4 小鼠肝功能測定 肝臟缺血再灌注后12 h處死小鼠，其中包括以下分組：（1）ZIP13fl/fl-Sham組、ZIP13fl/fl+I1R12 組、ZIP13LKO+I1R12 組，每組小鼠各4 只。（2）Vector-Sham 組、Vector+I1R12 組、ZIP13OE+I1R12 組，每組小鼠各4 只。采用心臟穿刺法收集血液，4℃靜置過夜，2 000×g 離心20 min，取血清，按照試劑盒說明書檢測ALT 和AST 含量。

1.2.5 肝臟組織病理學檢測 肝臟缺血再灌注后24 h 處死小鼠，其中包括以下分組：（1）ZIP13fl/fl-Sham組、ZIP13fl/fl+I1R24 組、ZIP13LKO+I1R24 組，每組小鼠各4 只。（2）Vector-Sham 組、Vector+I1R24 組、ZIP13OE+I1R24 組，每組小鼠各4 只。肝組織經4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進行組織切片，HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織病理學改變。

1.2.6 肝臟組織鋅含量的測定 取適量肝組織，真空干燥箱干燥2 h 后稱重，剪碎后加入濃硝酸，120℃硝解1 h，13%硝酸定容至3 mL。配置標準Blank 液及含Zn2+標準品溶液，建立Zn2+濃度標準曲線。使用ICP-OES 在206.2 nm 波長對Zn2+濃度進行測量。

1.2.7 TUNEL 法染色檢測肝細胞凋亡 將石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，滴加20 μg/mL 不含DNase 的蛋白酶K，37℃孵育20 min 進行抗原修復。PBS 洗滌3 次，加入TUNEL 檢測液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗滌3 次，熒光顯微鏡觀察肝細胞凋亡。

1.2.8 Western 印跡檢測肝臟相關蛋白表達 取小鼠肝組織，在冰上剪成小塊，加入RIPA 裂解液（裂解液：PMSF=100：1）充分研磨，冰上靜置30 min，12 000×g，4℃離心15 min。取上清液用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白經變性后，配制12%分離膠和5%濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠內的蛋白轉移至PVDF 膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用TBST 洗滌3 次，每次10 min。一抗GAPDH（1∶2 000）、Caspase 9（1∶1 000）、Caspase3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、CHOP（1∶500）、GRP78（1∶5 000）4℃孵育過夜。第二天用TBST 洗滌3 次，每次10 min。二抗Anti-rabbit IgG（1∶2 000）Anti Mouse IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min。化學發光液顯色曝光，用Image J 軟件分析，其中以GAPDH 為內參，以目的蛋白與內參的灰度值比值反應目的蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 肝臟特異性ZIP13 基因敲除（ZIP13LKO）小鼠和過表達（ZIP13OE）小鼠的鑒定 分別提取8 周齡ZIP13fl/fl、ZIP13LKO、Vector 和ZIP13OE小鼠肝臟組織蛋白，檢測ZIP13 蛋白表達，如圖1 所示，與ZIP13fl/fl小鼠相比，ZIP13LKO小鼠肝臟中ZIP13 表達明顯下降（t=6.26，P＜0.01）；與Vector 小鼠相比，ZIP13OE小鼠肝臟ZIP13 蛋白表達明顯增加（t=4.17，P＜0.05）。

圖1 Western 印跡檢測ZIP13 蛋白在ZIP13LKO 和ZIP13OE 小鼠肝臟中的表達Fig 1 Expressions of ZIP13 protein in ZIP13LKO and ZIP13OE mice detected by Western blotting analysis

2.2 ZIP13 對小鼠肝功能的影響 與ZIP13fl/fl-Sham 組相比，ZIP13fl/fl+I1R12 組血清ALT、AST 水平顯著升高（t=11.43、13.70，均P＜0.001）；與ZIP13fl/fl+I1R12 組相比，ZIP13LKO+I1R12 組血清ALT、AST 水平顯著升高（t=2.95、3.20，均P＜0.05）（表1）。而與Vector+I1R12 組相比，ZIP13OE+I1R12 組血清ALT、AST 水平明顯下降（t=3.69、4.26，均P＜0.05）（表2）。

表1 各組小鼠ALT 和AST 活性的比較（）Tab 1 Comparison of ALT and AST activities in mice among various groups（）

表1 各組小鼠ALT 和AST 活性的比較（）Tab 1 Comparison of ALT and AST activities in mice among various groups（）

注：除Sham 組，其余小鼠均做肝臟缺血1 h 再灌注12 h（I1R12）處理；與ZIP13fl/fl-Sham 組相比，aP＜0.001；與ZIP13fl/fl+I1R12 組相比，bP＜0.05；ALT：丙氨酸氨基轉移酶；AST：門冬氨酸氨基轉移酶

表2 注射相應腺相關病毒后，各組小鼠ALT 和AST 活性的比較（）Tab 2 Comparison of ALT and AST activities in mice among various groups after AAV infection（）

表2 注射相應腺相關病毒后，各組小鼠ALT 和AST 活性的比較（）Tab 2 Comparison of ALT and AST activities in mice among various groups after AAV infection（）

注：除Sham 組，其余小鼠均做肝臟缺血1 h 再灌注12 h（I1R12）處理；與Vector-Sham 組相比，aP＜0.001；與Vector+I1R12 組相比，bP＜0.05；ALT：丙氨酸氨基轉移酶；AST：門冬氨酸氨基轉移酶

2.3 ZIP13 對小鼠肝臟形態學的影響 光鏡下觀察發現，ZIP13fl/fl-Sham 組肝索排列整齊，肝細胞形態正常，胞質染色均勻，核完整，肝竇無明顯擴展、淤血、炎細胞浸潤等病理改變（圖2A）。與ZIP13fl/fl-Sham 組相比，ZIP13fl/fl+I1R24 組肝臟肝索結構紊亂，細胞明顯水腫形成空泡結構，肝血竇受擠壓，有炎性細胞聚集、肝細胞壞死等病理改變（圖2A、2B）。與ZIP13fl/fl+I1R24 組相比，ZIP13LKO+I1R24 組肝細胞水腫更明顯，肝淤血更嚴重、肝細胞壞死更嚴重（圖2B、2C）。與Vector+I1R24 組相比，ZIP13OE+I1R24 組肝細胞水腫減輕，肝細胞壞死減輕，淤血與炎細胞浸潤等病理改變減輕（圖2E、2F）。

圖2 HE 染色在顯微鏡下觀察肝臟病理結構（400×）Fig 2 HE staining was used to observe the pathological structure of liver under microscope（400×）

2.4 ZIP13 對小鼠肝細胞內鋅水平的影響 在肝臟缺血再灌注時，與ZIP13fl/fl-Sham 組相比，ZIP13fl/fl+I1R24 組肝組織內鋅水平明顯降低（t=13.49，P＜0.001）；與ZIP13fl/fl+I1R24 組相比，ZIP13LKO+I1R24 組肝組織鋅含量進一步降低（t=3.29，P＜0.05）（圖3A）。與Vector+I1R24 組相比，ZIP13OE+I1R24 組肝組織鋅含量明顯上升（t=3.88，P＜0.05）（圖3B）。

圖3 ICP-OES 法測定肝臟Zn2+水平Fig 3 Liver Zn2+levels measured by ICP-OES

2.5 ZIP13 對小鼠內質網的影響 Western 印跡顯示，肝臟缺血再灌注時，與ZIP13fl/fl-Sham 組相比，ZIP13fl/fl+I1R24 組肝細胞內質網應激相關蛋白CHOP 和GRP78 的表達明顯增加（t=4.76、4.54，均P＜0.05）；與ZIP13fl/fl+I1R24 組相比，ZIP13LKO+I1R24 組CHOP和GRP78 蛋白表達進一步增加（t=2.60、2.98，均P＜0.05）（圖4A）；與Vector+I1R24 組相比，ZIP13OE+I1R24 組CHOP 和GRP78 蛋白表達降低（t=3.47、2.88，均P＜0.05）（圖4B）。

圖4 Western 印跡檢測CHOP 和GRP78 蛋白表達Fig 4 Expression of CHOP and GRP78 detected by Western blotting

2.6 ZIP13 對小鼠肝細胞凋亡的影響 從TUNEL結果上看，與ZIP13fl/fl-Sham 組相比，肝臟缺血再灌注后，肝細胞凋亡明顯增加（圖5A、5B、5C）；與ZIP13fl/fl+I1R24 組相比，ZIP13LKO+I1R24 組肝細胞凋亡小體明顯增加（圖5B、5C）；與Vector+I1R24 組相比，ZIP13OE+I1R24 組肝細胞凋亡小體減少（圖5E、5F）。Western 印跡顯示，與ZIP13fl/fl-Sham 組相比，ZIP13fl/fl+I1R24 組肝組織活化形式的凋亡蛋白Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3 表達升高（t=4.56、3.73，均P＜0.05），而未活化的凋亡蛋白Caspase9 和Caspase3以及抗凋亡蛋白Bcl-2 表達量降低（t=4.92、2.8、2.89，均P＜0.05）。與ZIP13fl/fl+I1R24 組相比，ZIP13LKO+I1R24 組活化形式的凋亡蛋白Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3 表達增加（t=3.44、2.49，均P＜0.05），而Caspase9、Caspase3 和Bcl-2 蛋白表達降低（t=2.62、3.43、3.07，均P＜0.05）（圖6A）。與Vector+I1R24 組相比，ZIP13OE+I1R24 組活化形式的凋亡蛋白C leaved Caspase9、Cleaved Caspase3 表達降低（t=3.02、2.96，均P＜0.05），而Caspase9、Caspase3 和Bcl-2 蛋白表達升高（t=2.8、3.02、2.64，均P＜0.05）（圖6B）。

圖5 TUNEL 染色后，共聚焦顯微鏡下檢測凋亡小體（400×）Fig 5 Apoptotic bodies detected by TUNEL staining kit under confocal microscope（400×）

圖6 Western 印跡檢測肝組織中凋亡蛋白Caspase 3 及裂解形式，Caspase 9 及裂解形式及抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達Fig 6 Apoptosis protein Caspase 3 and its cleaved form，Caspase 9 and its cleaved form and anti-apoptotic protein Bcl-2 detected in whole liver tissue lysates by Western blotting

3 討論

肝臟缺血再灌注損傷的發生機制十分復雜，與酸中毒、肝細胞鈣超載、氧自由基產生過多、Kupffer細胞與中性粒細胞浸潤及細胞因子等密切相關[10-11]。肝臟缺血再灌注損傷可嚴重損害肝功能，甚至產生不可逆的損害，從而導致多器官功能障礙的級聯反應[2]。在肝臟移植、肝癌切除等手術中，預防并減輕肝臟缺血再灌注損傷，是肝功能恢復和提高手術質量的關鍵[3]。

鋅離子可通過多種途徑調節相關炎癥信號轉導起到抗炎、抗氧化應激的作用[12]。研究表明，外源給予鋅能夠通過多種機制減輕肝臟缺血再灌注損傷[13-15]。本研究結果首次證實了肝臟缺血再灌注時，肝細胞內鋅水平顯著降低，這可能是肝臟缺血再灌注損傷的機制之一。近年來，鋅轉運蛋白在I/R 中的作用已成為國內外研究的熱點。哺乳動物細胞中鋅離子穩態主要由兩個鋅轉運蛋白家族來維持，即SLC39A（solute-linked carrier 39A，SCL39A）和SLC30A（solute-linked carrier 30A，SLC30A）。SLC39A 家族又稱ZIP（Zrt-and-Irt-like proteins）家族，其功能是將鋅離子從細胞外或細胞器內轉運到細胞質中，以增加胞漿鋅離子濃度，而SLC30A 家族的主要作用是將鋅離子從細胞質轉移到細胞器內和細胞外，以降低細胞漿鋅離子濃度[16-17]。ZIP13 是SLC93A 成員之一，位于高爾基體、內質網等細胞器內。Bin 等[18]證明，ZIP13 基因突變通過含纈氨酸蛋白連接的泛素-蛋白酶體途徑加速蛋白質降解，降低功能蛋白水平，引起細胞內鋅穩態紊亂，導致脊椎軟骨發育性Ehlers-Danlos 綜合征（SCD-EDS）。研究表明，ZIP13 通過減少CCAAT 增強子結合蛋白β 蛋白在抑制脂肪細胞褐變中起關鍵作用[19]。然而ZIP13 在肝臟缺血再灌注損傷中的具體作用還不清楚。本研究發現，ZIP13的敲除導致肝細胞內鋅水平降低，肝臟缺血再灌注損傷加重，而過表達ZIP13 則會升高肝細胞內鋅水平，減輕缺血再灌注損傷。這些結果提示ZIP13 是肝細胞內起主要作用的鋅轉運蛋白，能夠通過維持肝細胞鋅穩態保護肝臟。

肝細胞代謝活躍，含有豐富的內質網結構，內質網是真核細胞修飾和分泌蛋白的重要場所，參與鈣穩態、蛋白質折疊和脂質生物合成等[20]。當肝細胞缺血缺氧再灌注后，會導致大量未折疊蛋白質或錯誤折疊的蛋白質聚集在內質網，引起內質網應激[21]。適度的內質網應激可通過抑制蛋白質合成而促進錯誤折疊蛋白質降解起到保護作用，這一過程稱為未折疊蛋白反應（UPR），而持續過強的內質網應激則會超過UPR 能力，引起細胞凋亡，進而引起嚴重的肝損傷[22-23]。內質網應激標志性蛋白是GRP78 和CHOP 蛋白，GRP78 是一種分子伴侶熱休克蛋白，是正常細胞內質網中UPR 的主體。當內質網應激發生時，GRP78 活性增強，它與錯誤折疊的蛋白質或未折疊的蛋白質結合成復合物，以促使其恢復正常結構，并維持內質網穩態[24]。CHOP 蛋白在細胞凋亡、自噬中起重要作用[25]。CHOP 蛋白是內質網應激時啟動細胞凋亡的標志性蛋白。內質網應激時，CHOP蛋白的高表達可通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 而誘導細胞凋亡[26]。本研究發現，肝臟缺血再灌注時，肝細胞GRP78 和CHOP 蛋白明顯升高，內質網應激明顯加重。ZIP13 敲除會進一步加重內質網應激；而過表達ZIP13 則減輕內質網應激。這些結果提示，ZIP13可能通過參與調控內質網應激，從而在肝臟缺血再灌注中發揮重要作用。

細胞凋亡是肝缺血再灌注過程中的病理生理特征之一。半胱天冬酶家族是凋亡的關鍵介質。其中Caspase3 是細胞凋亡的典型標志物，活化的Caspase3 在凋亡細胞的染色質凝聚和DNA 斷裂中起到關鍵作用。因此Caspase3 在凋亡小體形成的過程中是必不可少的。Caspase9 是Caspase3 的上游調控蛋白，活化的Caspase9 能激活Caspase3，從而啟動細胞凋亡[27-28]。本研究結果表明，肝臟缺血再灌注時，ZIP13 的敲除能夠促進肝細胞凋亡，造成嚴重的肝損傷；而過表達ZIP13 則可降低肝細胞凋亡，減輕肝損傷。這些結果提示，ZIP13 還可通過調控細胞凋亡參與肝臟缺血再灌注損傷。

綜上所述，本研究首次證實了肝臟缺血再灌注時，肝細胞內鋅水平顯著降低可能是缺血再灌注損傷的機制之一。并且在此基礎上，筆者首次證實鋅轉運體ZIP13 能夠通過維持肝細胞鋅穩態來調控內質網應激和細胞凋亡，從而發揮肝臟保護作用。