ARID1A 表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌免疫細(xì)胞浸潤及預(yù)后的相互關(guān)系研究

張澤武，張偉

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院肝膽腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治重點(diǎn)”實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300060）

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二常見的原發(fā)性肝癌，約占所有胃腸道腫瘤的3%[1-2]。ICC 是一種高度侵襲性惡性腫瘤，目前肝內(nèi)膽管癌發(fā)病率仍呈上升趨勢[3]，總體預(yù)后較差，根治性手術(shù)目前仍是主要的治療手段，對于晚期或不可切除的患者，局部和全身化療是主要的治療選擇。即使接受手術(shù)治療，術(shù)后5 年生存率仍低于20%[4]。

近年來免疫治療的快速發(fā)展，為ICC 的治療提供了新的選擇[5]。隨著二代測序技術(shù)的應(yīng)用，在ICC 中發(fā)現(xiàn)了許多常見的基因突變，例如IDH1/2、KRAS、BAP1、ARID1A、PBRM1 和FGFR2 等[6]。這些腫瘤驅(qū)動基因的突變是否直接影響腫瘤免疫表型，以及能否作為生物指標(biāo)為臨床治療提供指導(dǎo)，仍需進(jìn)一步研究。

AT 富含結(jié)構(gòu)域1A 基因（AT-rich interaction domain 1A，ARID1A）是惡性腫瘤中最常見的突變基因之一，大多數(shù)ARID1A 突變是失活突變，導(dǎo)致其表達(dá)缺失[7]。在多種腫瘤中已發(fā)現(xiàn)其表達(dá)的降低與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[8-9]，且已有研究發(fā)現(xiàn)ARID1A 表達(dá)缺失與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的改變以及免疫檢查點(diǎn)阻斷的治療反應(yīng)有關(guān)[10-11]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞肝癌中ARID1A 可以通過增加CYP450 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激促進(jìn)啟動，而腫瘤內(nèi)ARID1A 的缺失降低了染色質(zhì)可及性，并降低了與遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄[12]。ARID1A 的表達(dá)可用于預(yù)測肝癌的預(yù)后，即ARID1A 表達(dá)水平高的患者的預(yù)后較差，在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)降低ARID1A 表達(dá)顯著減慢細(xì)胞周期并抑制HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[13]。本研究旨在進(jìn)一步探討在ICC 中ARID1A 表達(dá)與腫瘤免疫環(huán)境之間關(guān)系，分析預(yù)后價值以及臨床病理特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究共納入了2011 年1 月—2017 年12 月在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的ICC 患者136 例，男性74 例，女性62 例，年齡28～77 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理最終診斷為ICC 的患者。（2）患者具有完整的臨床病理資料。（3）有組織蠟塊，確保腫瘤和癌旁的石蠟切片完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）由典型的肝細(xì)胞癌（HCC）和典型的ICC 組成的混合HCC-ICC 病例。（2）術(shù)前接受射頻消融、輔助化療或放療等治療的患者。根據(jù)2017 年第8 版AJCC 分期系統(tǒng)對所有患者進(jìn)行分期。研究實(shí)施前醫(yī)院倫理通過，所有患者或其法定監(jiān)護(hù)人均簽署書面知情同意。

1.2 標(biāo)本制備與染色 收集來自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科136 例手術(shù)標(biāo)本，組織經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋，并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。通過從每個病例中選擇有代表性的腫瘤區(qū)域和典型的瘤周區(qū)域，構(gòu)建由福爾馬林固定、石蠟包埋腫瘤組織的2 mm核心組成的組織微陣列（tissue microarrays，TMAs），用于各種免疫組化染色。免疫組織化學(xué)染色：TMAs芯片在65℃干烤箱中過夜，第2 天在二甲苯和梯度乙醇中逐步脫蠟。在抗原修復(fù)后，用3%過氧化氫處理10 min，抑制內(nèi)源性過氧化物活性。然后在室溫下使用抗體孵育樣品30 min，在4°C 下過夜。洗滌后，組織微陣列與二抗在室溫下孵育1 h。用3，3-二氨基聯(lián)苯胺溶液（ZSGB-Bio）處理并用蘇木精復(fù)染。使用的一抗如下：ARID1A（clone EPR13501-73；稀釋倍數(shù)：1∶500；Abcam），CD4（ab 133616；稀釋倍數(shù)：1∶500；Abcam），CD8（ab17147；稀釋倍數(shù)：1∶50；Abcam），CD163（ab74604；稀釋倍數(shù)：1 ∶25；Abcam），CD66b（ab 197678；稀釋倍數(shù)：1∶1 000；Abcam）。免疫組化檢測結(jié)果判定：ARID1A 表達(dá)只有核染色陽性被定義為表達(dá)，陽性腫瘤細(xì)胞比例采用半定量評分系統(tǒng)：＜1%評分0（無表達(dá)）；1%至90%評分1（局灶性或區(qū)域性陽性）；91%至100%評分2（彌漫陽性），評分為0、1 定義為ARID1A 表達(dá)缺失（陰性），評分為2 定義為ARID1A 表達(dá)（陽性）。CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞、CD163+巨噬細(xì)胞和CD66b+中性粒細(xì)胞均計數(shù)4 個20 倍鏡視野的陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。然后以中位數(shù)為截斷值，分為高浸潤組和低浸潤組。所有實(shí)驗(yàn)由專業(yè)的病理醫(yī)師進(jìn)行染色評分。

1.3 隨訪 隨訪開始于手術(shù)日，截止于2019 年4 月，通過電話隨訪以及定期復(fù)診獲取相應(yīng)的數(shù)據(jù)，隨訪內(nèi)容包括：生存狀態(tài)、體力狀態(tài)、肝功能、腫瘤標(biāo)志物和強(qiáng)化CT 或MRI。中位隨訪時間為22.68 個月（2.87～100 個月）。其中無病生存期（disease free survival，DFS）定義為從手術(shù)日期至腫瘤復(fù)發(fā)或者最后一次隨訪的間隔時間。總生存期（overall survival，OS）定義為從手術(shù)日期至患者因腫瘤死亡或者最后一次隨訪的間隔時間。

1.4 數(shù)據(jù)庫分析 使用TIMER 在線數(shù)據(jù)庫（腫瘤免疫評估資源，https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）來系統(tǒng)地分析ARID1A 拷貝數(shù)改變的腫瘤組織中6種常見免疫細(xì)胞（B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）浸潤水平，從而進(jìn)行泛癌種分析。腫瘤細(xì)胞ARID1A 拷貝數(shù)水平由GISTIC2.0 定義，包括深度缺失、臂水平缺失、二倍體/正常和臂水平增益。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用了SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布連續(xù)變量采用t 檢驗(yàn)，針對分類變量采用卡方檢驗(yàn)或Fisher's 精確檢驗(yàn)等分析基本臨床指標(biāo)和ARID1A 相關(guān)性。通過Kaplan-Meier 法計算DFS 和OS。采用雙邊Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析腫瘤組織中ARID1A 基因拷貝數(shù)水平與腫瘤免疫浸潤的關(guān)系。P＜0.05 視為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARID1A 的表達(dá) 136 例肝內(nèi)膽管癌組織中ARID1A 在108 例（79.4%）中呈現(xiàn)彌漫性陽性，而在24 例（17.6%）和4 例（2.9%）中分別顯示表達(dá)完全缺失和局灶性缺失。ARID1A 代表性免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖1 所示。

圖1 免疫組化法檢測ARID1A 蛋白表達(dá)（200×）Fig 1 The expression of ARID1A protein detected by immunohistochemical method（200×）

2.2 免疫細(xì)胞在腫瘤和癌旁組織中表達(dá)以及浸潤水平 在不同的ICC 組織樣本中，CD4+、CD8+的T淋巴細(xì)胞，CD163+巨噬細(xì)胞和CD66b+中性粒細(xì)胞的數(shù)量差異顯著，見圖2。與癌旁組織相比，CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞，CD163+巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中浸潤明顯減少（t=6.962、7.364、7.905，均P＜0.000 1），而CD66b+中性粒細(xì)胞在腫瘤組織浸潤明顯增加（t=4.093，P＜0.000 1），見圖3。

圖2 不同指標(biāo)免疫組化染色結(jié)果（200×）Fig 2 Immunohistochemical staining results of different indexes（200×）

圖3 癌和癌旁組織中免疫細(xì)胞中浸潤比較Fig 3 Comparison of immune cell infiltration in tumor and para-tumor

2.3 ARID1A 和免疫細(xì)胞的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性 136 例患者成功隨訪120 例，失訪15 例，1 例死于與腫瘤無關(guān)的原因。中位隨訪時間22.68 個月。120 例中復(fù)發(fā)82 例，死亡54 例。ARID1A 缺失組預(yù)后較好，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤水平的高低，在ARID1A 表達(dá)組和缺失組中進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)在ARID1A 表達(dá)缺失組和ARID1A 表達(dá)組中CD163+巨噬細(xì)胞的浸潤水平與生存呈負(fù)相關(guān)（log-rank χ2=5.399、6.376，P=0.02、0.012）。而ARID1A 表達(dá)與CD4、CD8 和CD66b的浸潤水平、生存預(yù)后之間均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖4。

圖4 ARIDA 和免疫細(xì)胞的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Fig 4 The relationship between the expression of ARIDA and multiple immune cells and prognosis

2.4 ARID1A 與臨床病理特征的相關(guān)性 ARID1A的表達(dá)與肝硬化呈正相關(guān)（χ2=7.126，P＜0.01），而性別、年齡、肝功能分級等與ARID1A 的表達(dá)不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 ARID1A 的表達(dá)與各病理參數(shù)之間的相關(guān)性[n（%）]Tab 1 Correlation between the expression of ARID1A and pathological parameters[n（%）]

2.5 ARID1A 與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系 與表達(dá)ARID1A 相比，CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞和CD163+巨噬細(xì)胞在ARID1A 表達(dá)缺失的ICC中的浸潤明顯降低（t=2.174、1.998、2.162，均P＜0.05），CD66b+中性粒細(xì)胞免疫浸潤水平與ARID1A 的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。

圖5 ICC 中ARID1A 的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系Fig 5 Relationship between expression of ARID1A and immune cell infiltration in ICC

2.6 數(shù)據(jù)庫分析ARID1A 拷貝數(shù)水平與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系 通過TIMER 在線數(shù)據(jù)庫分析不同癌種中ARID1A 基因拷貝數(shù)水平的改變與6 種常見免疫細(xì)胞（B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）之間關(guān)系。發(fā)現(xiàn)相比于二倍體/正常狀態(tài)，在乳腺癌basal-like 型和低級膠質(zhì)瘤中，ARID1A 臂水平缺失狀態(tài)與多數(shù)免疫細(xì)胞浸潤降低相關(guān)（P＜0.05），見圖6。

圖6 TIMER 數(shù)據(jù)庫分析ARID1A 基因拷貝數(shù)水平與腫瘤免疫浸潤的關(guān)系Fig 6 Relationship between the change of ARID1A gene copy number level and tumor immune invasion analyzed by TIMER database

3 討論

ARID1A（BAF250A）是染色體重構(gòu)復(fù)合物SWI/SNF 的一個亞基，有助于蛋白質(zhì)與DNA 的相互作用[14]。ARID1A 也是癌癥中最常見的突變基因之一，大多數(shù)ARID1A 突變是失活突變并導(dǎo)致ARID1A表達(dá)缺失[7]。

ARID1A 在乳腺癌[15]、肝細(xì)胞癌[16]和胃癌[9]中通常被認(rèn)為是一種抑癌基因，已有相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)在ICC 中較低的ARID1A 表達(dá)與較低的生存率和無病生存率相關(guān)[8]。但也有研究發(fā)現(xiàn)ARID1A 高表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌的低生存率和高復(fù)發(fā)率相關(guān)，這種差異可能與ARID1A 在肝臟腫瘤抑制和致癌性中的雙重作用相關(guān)[17]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，ARID1A 表達(dá)缺失組有較好的生存和預(yù)后傾向，但是并不具有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與ARID1A 表達(dá)缺失的患者數(shù)過少有關(guān)。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，ARID1A 突變導(dǎo)致干擾素（IFN）基因表達(dá)受損，腫瘤浸潤T 細(xì)胞匱乏，腫瘤免疫力低下，宿主存活時間縮短。而IFN 信號受損與免疫治療反應(yīng)差有關(guān)[10]。ARID1A 缺乏導(dǎo)致腫瘤Th1型趨化因子表達(dá)和T 細(xì)胞腫瘤浸潤不良，并阻礙體內(nèi)自發(fā)的腫瘤免疫[10]。通過TIMER 在線數(shù)據(jù)庫分析，在部分癌中例如乳腺癌basal-like 型和低級膠質(zhì)瘤，其ARID1A 拷貝數(shù)的缺失與多數(shù)免疫細(xì)胞浸潤降低相關(guān)。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，ARID1A 表達(dá)缺失與CD4+、CD8+T 細(xì)胞和CD163+巨噬細(xì)胞浸潤減少有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，不管在ARID1A 表達(dá)缺失組和ARID1A 表達(dá)保留組中CD163+巨噬細(xì)胞的浸潤水平與生存呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumour-associated macrophages，TAMs）可分為兩種表型M1 和M2 亞型[18]，M1 型TAMs（經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞）表現(xiàn)為促炎和抗腫瘤特性，而M2 型TAMs（選擇活化的巨噬細(xì)胞）是促進(jìn)腫瘤生長、血管生成和抑制適應(yīng)性免疫[19]。CD68、CD163 是常用于檢測腫瘤標(biāo)本TAMs 的生物標(biāo)志物，CD68 可以識別整個TAMs 群體，而CD163 在M2 型TAMs 表達(dá)[20]。多項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，M2 型TAMs 浸潤水平與胃癌[21]、淋巴瘤[22]、腎細(xì)胞癌[23]和肝內(nèi)膽管癌[24]患者的不良預(yù)后相關(guān)。

臨床上ARID1A 的突變往往伴隨著較高的腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB），多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)ARID1A 缺陷損害錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR），并與微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性（microsatellite instability-high，MSI-H）、高TMB、程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）表達(dá)升高相關(guān)聯(lián)[11]，而這些都是免疫治療有效的標(biāo)志物[25]。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在膽管癌以及其他多個腫瘤中，ARID1A 的表達(dá)缺失會抑制包括CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD163+巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的浸潤。而在本研究中CD163+巨噬細(xì)胞的浸潤與生存呈負(fù)相關(guān)，推測ARID1A 的表達(dá)缺失可能通過抑制CD163+巨噬細(xì)胞的浸潤，從而使該組患者有著較好生存和預(yù)后的傾向。要想進(jìn)一步闡明ARID1A的表達(dá)與ICC 患者生存預(yù)后的關(guān)系以及ARID1A的缺失是否可以作為膽管癌免疫治療的潛在標(biāo)志物，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究。