組蛋白去乙酰化酶抑制劑LBH589 抑制基底樣乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移

莊慧萍

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室；國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心；天津市“腫瘤防治”重點實驗室；天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心；乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津 300060）

基底樣乳腺癌（basal-like breast cancer，BLBC）是惡性程度較高的乳腺癌亞型，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，死亡率較高[1]。BLBC 由于雌激素受體、孕激素受體及表皮生長因子受體2 表達缺失，在臨床中缺乏有效的靶向治療和內(nèi)分泌治療方法，因此尋找新的治療靶點是迫切需要解決的問題[2]。BLBC 通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的發(fā)生獲得較強的遷移、侵襲能力。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是復(fù)雜的生物學(xué)過程，受多重因素的影響，其中表觀遺傳調(diào)控起著重要作用[3]。組蛋白乙酰化水平是由組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）共同調(diào)節(jié)，其中HDACs 的過度表達會導(dǎo)致去乙酰化作用增強，使松弛的核小體變得緊密，影響基因轉(zhuǎn)錄，抑制多種腫瘤抑制基因的表達，促進腫瘤的發(fā)展[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)多種HDACs 如HDAC4、HDAC6、HDAC8 等在BLBC 中表達上調(diào)[6-7]。

HDAC 抑制劑（histone deacetylaseinhibitors，HDACIs）通過抑制腫瘤細(xì)胞中的HDACs，提高細(xì)胞的乙酰化水平，激活腫瘤抑制基因的表達[8]，在多種癌癥中發(fā)揮抗腫瘤作用[9-12]。HDACs 屬于去乙酰化酶超家族，根據(jù)結(jié)構(gòu)同源性分析，共有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 型[13]。根據(jù)HDACs 的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用靶點，HDACIs 主要包括羥肟酸類、環(huán)四肽類、短鏈脂肪酸和苯酰胺類，其中前三類化合物為廣譜性抑制劑，抑制Ⅰ、Ⅱ型家族所有HDACs 亞型，苯酰胺類主要抑制Ⅰ型HDACs 中HDAC1、HDAC2、HDAC3 和部分Ⅱ型HDACs，屬于選擇性抑制劑[14]。廣譜性抑制劑LBH589 屬于羥肟酸類，研究顯示它在急性髓系白血病[15]、膠質(zhì)瘤[16]、肺癌[17]和乳腺癌[18]中都有良好的抗腫瘤活性，2015 年經(jīng)FDA 批準(zhǔn)臨床應(yīng)用于治療多發(fā)性骨髓瘤[19]。目前，LBH589 在BLBC 治療中的研究較少，本研究通過體內(nèi)外實驗探討LBH589 對BLBC 生長和轉(zhuǎn)移的作用，以期為BLBC 的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC），小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素購于美國Gibco 公司；LBH589 購于美國Selleckchem 公司；Transwell 小室和Matrigel 基質(zhì)膠購于Corning 公司；吉姆薩染液購于上海生工生物工程股份有限公司；β-Actin 抗體購于英國Abcam公司；CDH1 抗體、VIM 抗體購于美國CST 公司；FN1 抗體購于美國BD 公司；山羊抗鼠二抗購于美國CST 公司；無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性Balb/c 小鼠，購于江蘇集萃藥康生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和100 μg/mL 青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。實驗所用細(xì)胞均為對數(shù)生長期細(xì)胞。LBH589 溶于二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），以0.1 μmol/L 的終濃度處理細(xì)胞24 h。

1.2.2 增殖實驗 MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞分別設(shè)置對照組（DMSO）和LBH589 給藥組（0.1 μmol/L），以5×103個細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板，每組6 個復(fù)孔，用3-（4，5 二甲基噻唑溴唑-2-基）-2，5-二苯四化銨［3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］法測定并比較細(xì)胞的增殖能力。在第0、1、2、3 和4 天，分別在每孔加入10 μL MTT（0.5 mg/mL）溶液后在37℃孵育4 h。去除培養(yǎng)基后，每孔加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處的吸光值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3 平板克隆實驗 實驗分組同1.2.2。分別取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞，用胰酶消化并配制單細(xì)胞懸液備用，將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每孔50、100、200 個細(xì)胞的梯度密度分別接種6 孔板中，使細(xì)胞分散均勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 周。培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS 小心浸洗2 次，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。然后去固定液，加適量吉姆薩染液染10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，拍照并計算克隆形成數(shù)。

1.2.4 遷移和侵襲實驗 實驗分組同1.2.2。遷移實驗：Transwell 小室放入24 孔板中，下室中加入750 μL含20%血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基。用胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，用無血清培養(yǎng)基配制細(xì)胞濃度為5×104個/mL 的單細(xì)胞懸液，取500 μL 細(xì)胞懸液緩慢加入上室并混勻，培養(yǎng)12 h 后觀察細(xì)胞的遷移情況。侵襲實驗：Transwell 小室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠，余下步驟同遷移實驗。培養(yǎng)24 h 后觀察細(xì)胞的侵襲情況。遷移和侵襲實驗中Transwell 小室分別用棉簽擦拭去小室上層的細(xì)胞，室溫下用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用Giemsa 染液對細(xì)胞進行染色30 min，室溫風(fēng)干，中性樹膠固定封片。顯微鏡下觀察穿過孔的細(xì)胞，隨機選取5 個視野拍照并計數(shù)。

1.2.5 實時熒光定量PCR 實驗 實驗分組同1.2.2。MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞分別接種于6 孔板，使用LBH589 處理24 h 后，收取細(xì)胞。提取總RNA 后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進行RT-qPCR。引物序列如表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer Sequences

1.2.6 免疫印跡實驗 實驗分組同1.2.2。MDAMB-231 和4T1 細(xì)胞分別接種于6 孔板，使用LBH589處理24 h 后，收取細(xì)胞并提取蛋白，檢測蛋白濃度。配制SDS-PAGE 凝膠（10%濃縮膠、5%分離膠）、電泳、轉(zhuǎn)膜，使用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，分別加入一抗CDH1（1∶1 000）、VIM（1∶1 000）、FIN1（1∶1 000）和內(nèi)參β-Actin（1∶8 000），4℃孵育過夜，TBST 洗膜后加入對應(yīng)的二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h 后TBST 洗膜，加入ECL 反應(yīng)液進行壓片、曝光、顯影和定影。

1.2.7 動物實驗 4～6 周齡的12 只Balb/c 雌鼠，按照數(shù)字表法隨機分為兩組，每組6 只，將1 × 105個4T1 細(xì)胞接種于小鼠乳腺脂肪墊。當(dāng)小鼠原位瘤體積生長至50～100 mm3時，實驗組小鼠腹腔注射LBH589（10 mg/kg），對照組給予同等體積的溶劑（2% DMSO+48% PEG 300+2% Tween 80+ddH2O），每周3 次。每3 天測量原位瘤最長直徑（a）和最短直徑（b），計算移植瘤的體積（V，mm3）=（1/2）×a×b2。給藥4 周后處死并解剖小鼠，取原位瘤組織和肺組織并用甲醛固定，統(tǒng)計原位瘤體積，通過肺組織HE染色觀察其病理學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析和t 檢驗進行差異分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LBH589 抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力 通過MTT 實驗和平板克隆實驗檢測LBH589 對MDAMB-231 和4T1 細(xì)胞增殖作用的影響。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，LBH589 能夠顯著抑制MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞的增殖能力（t=11.37，P＜0.05；t=18.18，P＜0.05）和細(xì)胞集落形成能力（t=7.76，P＜0.05；t=15.22，P＜0.05）（圖1）。

圖1 LBH589 抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力Fig 1 The proliferation of breast cancer cells inhibited by LBH589

2.2 LBH589 抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力 Transwell 方法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)LBH589 處理的MDAMB-231 和4T1 細(xì)胞遷移（t=8.8，P＜0.05；t=18.0，P＜0.05）和侵襲（t=8.24，P＜0.05；t=15.99，P＜0.05）能力降低（圖2）。

圖2 LBH589 抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力Fig 2 The migration and invasion of breast cancer cells inhibited by LBH589

2.3 LBH589 抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT 為了進一步研究LBH589 對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的作用，通過RT-qPCR 和Western 印跡實驗檢測LBH589 對乳腺癌細(xì)胞EMT 標(biāo)志物CDH1、VIM 和FN1 的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，LBH589 顯著上調(diào)CDH1 的mRNA 表達（t=7.33，P＜0.05），顯著抑制VIM 和FN1的mRNA（t=5.57，P＜0.05；t=6.3，P＜0.05）和蛋白（t=8.37，P＜0.05；t=11.3，P＜0.05）表達水平（圖3）。

圖3 LBH589 抑制乳腺癌細(xì)胞的EMTFig 3 The EMT in breast cancer cells inhibited by LBH589

2.4 LBH589 抑制小鼠乳腺腫瘤生長及肺轉(zhuǎn)移 通過測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線（圖4A），結(jié)果顯示，與對照組相比，LBH589 顯著抑制腫瘤生長（P＜0.05）；在接種39 d 時通過解剖獲得小鼠原位瘤組織（圖4B），結(jié)果顯示，與對照組相比，LBH589 給藥組腫瘤體積顯著減小（t=6.3，P＜0.05）；對解剖獲得的肺組織進行HE 染色（圖4C），結(jié)果顯示，LBH589顯著抑制小鼠肺轉(zhuǎn)移（P＜0.05）。

圖4 LBH589 抑制小鼠乳腺腫瘤生長及肺轉(zhuǎn)移Fig 4 The growth and lung metastasis of breast tumor in mice inhibited by LBH589

3 討論

臨床中多采用化療方法抑制BLBC 患者病情發(fā)展，但其耐藥率較高，不良反應(yīng)較多，治療效果較差[1]。因此，尋找更好的靶向治療藥物是BLBC 治療的重點。HDAC 等表觀遺傳修飾異常存在于腫瘤的發(fā)展進程中，由于表觀遺傳修飾具有可逆性，因此可以通過表觀遺傳抑制劑控制修飾過程，使某些關(guān)鍵抑癌基因恢復(fù)功能，從而起到抗腫瘤作用[20]。目前認(rèn)為HDACIs 主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡和抑制血管生成等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。

研究顯示LBH589 可以有效抑制與癌癥進展有關(guān)的HDACs，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[22]。Singh等[23]發(fā)現(xiàn)LBH589 促進結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡；Schmitz等[24]發(fā)現(xiàn)LBH589 呈劑量依賴性地促進人和鼠神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡；Qin 等[25]發(fā)現(xiàn)LBH589 抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進細(xì)胞凋亡，通過構(gòu)建MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤模型發(fā)現(xiàn)LBH589 抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。Lee 等[26]研究發(fā)現(xiàn)LBH589 和DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑聯(lián)合使用可以作為乳腺癌的潛在治療方法。EMT 是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，有助于胚胎發(fā)育和組織纖維化，在腫瘤細(xì)胞的起始、干細(xì)胞的分化以及腫瘤細(xì)胞對治療的抵抗中起著重要的作用[27]。EMT 程序的異常激活與腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和治療性耐藥的獲得有關(guān)[28]。Kai 等[29]研究證實LBH589 聯(lián)合乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer stem cells，BCSCs）靶向藥物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期和調(diào)節(jié)EMT 發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究利用4T1 乳腺癌細(xì)胞Balb/c 小鼠模型，進一步證實了LBH589 抑制BLBC 的生長和轉(zhuǎn)移，同時體外實驗證實了LBH589 抑制BLBC 細(xì)胞的增殖，通過抑制細(xì)胞的EMT 抑制細(xì)胞遷移和侵襲，為BLBC 的臨床靶向治療進一步提供了理論基礎(chǔ)。在腫瘤治療策略中，LBH589 目前已成功應(yīng)用于多種聯(lián)合治療，包括與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[26]和免疫檢查點抑制劑[30]等藥物聯(lián)合的應(yīng)用。隨著對LBH589 在BLBC治療中的作用和機制有更深層次的了解，未來會發(fā)現(xiàn)更有效的聯(lián)合治療策略，為改進BLBC 治療帶來新的機會。