宮頸癌細胞PAX1 基因甲基化的CRISPR 靶向調控系統的構建

張文帆，楊金豪，陳爽，時淑娟，王蓉

（1.天津醫科大學醫學檢驗學院，300203 天津；2.天津醫科大學基礎醫學院解剖教研室，300070 天津）

配對基因盒1（paired box1，PAX1）基因屬于Pax家族，是一種重要的轉錄因子[1]，參與骨骼的發育形成[2]。早期研究表明，PAX1 基因在脊柱畸形[3]的發生、胸腺及甲狀旁腺器官發育中上皮細胞的死亡及增殖[4-5]中發揮重要作用。近來，隨著對DNA 甲基化的深入研究，PAX1 基因高甲基化與宮頸癌發生的相關性被廣為報道[6]。此外，PAX1 基因甲基化與卵巢癌[7]、甲狀旁腺癌[8]、口腔鱗癌[9]、頭頸癌[10]、食管鱗癌[11]等的關系亦有報道。

DNA 甲基化引起的基因異常表達是一個可逆的過程，這為腫瘤的治療提供了希望。但由于缺乏特異性干擾基因甲基化的靶向調控工具，限制了其藥物的臨床應用和甲基化基因標志物功能的深入研究。而CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技術的誕生則為解決以上這些研究難點帶來了曙光。此外，CRISPR 系統里具有“剪刀”功能的Cas9 蛋白可被改造成dCas9（dead Cas9），既保留了與靶位點結合的功能，還可以附加激活[12]、抑制[13]、加甲基化和去甲基化[14]等效應分子，變成具有調控基因表達功能的工具，這為靶向甲基化基因的功能研究及藥物開發開辟了道路。因此，本研究旨在采用最新的CRISPR 技術構建靶向宮頸癌PAX1 基因甲基化的調控系統，為后續的靶向治療和基因功能的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞培養 人宮頸癌細胞CaSki（HPV18+）及SiHa（HPV16+）細胞系，正常細胞（人胚腎細胞HEK293T）（購自中舟新喬，上海），在含有10%胎牛血清（BI，美國）、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素（索萊寶，北京）的RPMI 1640、MEM、DMEM（HyClone，美國）培養基中分別進行培養。

1.2 單導向RNA（single guide RNA，sgRNA）設計、合成及質粒轉染 經CRISPR-EAR 在線網站（http：//crispr-era.stanford.edu/）[15]設計靶向PAX1 基因啟動子區域的sgRNA，選取評分較高的4 個用于激活基因表達的sgRNA（act-sgRNA）（表1），通過Q5 超保真聚合酶（NEB，美國）進行體外兩步PCR 法合成，純化后存于-20℃。質粒Fuw-dCas9-Tet1CD（dCas9 -Tet1，#84475），Fuw -dCas9 -Tet1CD_IM（dCas9-Tet1m，Tet1 突變體，#84479）均來自于Addgene[14]。將每孔5×105個的細胞接種到6 孔板，24 h 后在6 孔板中共轉染dCas9-Tet1CD（實驗組）或dCas9-Tet1m（對照組）和單獨或組合的actsgRNA，48 h 后加入含有zeocin（Invitrogen，美國）的培養基進行篩選。3 d 后收集細胞，分別提取DNA和RNA。

表1 用于靶向激活PAX1 基因表達的sgRNA 序列Tab 1 The sgRNA sequences for targeted activation of PAX1 expression

1.3 RNA 提取及熒光定量PCR（Real time PCR，RTPCR）用Trizol 試劑（Inviterogen，美國）提取細胞的總RNA，并使用Nano Drop2000c 檢測RNA 的濃度和質量，取1 800 ng RNA 根據FastQuant RT 試劑盒（天根，中國）說明書進行逆轉，以cDNA 為模板，采用SYBR green 試劑盒檢測mRNA 的表達（GADPH 為內參），引物序列見表2。

表2 RT-PCR 引物Tab 2 The primers for RT-PCR

1.4 DNA 的亞硫酸處理（BS）和甲基化特異性PCR（MSP）DNA 提取同前所述采用氯酚法[16]。將抽提的DNA 通過Nano Drop2000c 進行濃度和質量檢測后，健康女性的白細胞DNA 作為陰性對照（Leu），健康女性白細胞DNA 進行體外加甲基后作為陽性對照（IV）。參照EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）試劑盒說明書進行重亞硫酸氫鹽處理。上述BS 后的DNA 為模板，使用Methyl primer express軟件進行引物合成，序列見表3。采用Amplitaqgold酶（ABI，美國）進行PCR 反應，反應條件為：95℃預變性，5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，共40 個循環，72℃延伸10 min。反應產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad 成像分析儀觀察結果。

1.5 焦磷酸測序（Pyrosequencing）用PyroMark Assay Design 2.0 軟件進行引物設計（表3），對下游引物5'端進行生物素標記，以BS 后的DNA 為模板優化條件并進行PCR 擴增。按照PyroMark Q24 焦磷酸測序儀中甲基化分析要求對PCR 產物進行測序。

表3 MSP 及焦磷酸測序所用引物Tab 3 The primers for MSP and Pyro sequences

1.6 脫靶效應檢測 通過在線工具COSMID（https：//crispr.bme.gatech.edu/）[17]對PAX1-act-sgRNA3 的脫靶基因進行預測，選取具有脫靶可能的Top5 個基因，通過RT-PCR 檢測5 個基因在實驗組及對照組的表達差異，引物見表4。

表4 脫靶效應評分較高的前5 個基因Tab 4 The top 5 genes with high off-target effect score

1.7 免疫印跡（Western blotting）細胞經RIPA 裂解液裂解后分離并提取蛋白，利用BCA 法定量檢測蛋白含量，配置濃度為10%的SDS-PAGE 凝膠，每個加樣孔均加入等質量的蛋白，電泳后轉印至硝酸纖維素膜上，并置于5%的脫脂牛奶內封閉1.5 h，分別加入稀釋的一抗：GAPDH（Bioss），PAX1（Abcam）過夜孵育，第2 天加入對應種屬性的二抗，漂洗后加入ECL 發光試劑，置于Bio-Rad 凝膠成像儀成像，并通Image J 進行灰度值分析。

1.8 統計學處理 采用Graphpad Prism8.0 統計軟件對數據進行統計分析。計量資料經正態性檢驗，符合正態分布的用表示，兩組間表達差異比較采用t 檢驗，不符合正態分布的采用Mann-Whitney U 檢驗進行分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PAX1 基因的啟動子甲基化及表達水平驗證MSP 結果表明PAX1 基因啟動子在宮頸癌細胞CaSki 和SiHa 中呈現高甲基化，而在正常細胞HEK293T 細胞中呈現未甲基化（圖1A）。在轉錄水平，PAX1 在宮頸癌細胞的表達顯著低于HEK293T細胞（CaSki：t=9.13，SiHa：t=12.31，P＜0.05）（圖1B），同樣，PAX1 在宮頸癌細胞的蛋白表達水平亦低于HEK293T 細胞（CaSki：t=16.72，SiHa：t=11.81，P＜0.05）（圖1C）。

圖1 細胞系中PAX1 基因甲基化及表達水平驗證Fig 1 Validation the methylation and expression level of PAX1 in cells

2.2 靶向激活PAX1 基因表達，降低其啟動子的甲基化水平 將dCas9-Tet1 與4 個act-sgRNA 單獨或聯合共轉染后，CaSki 細胞系中，相對于對照組，實驗組act-sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4 及sgRNA1+2+3+4 共轉染組的PAX1 表達分別增加了3.49、35.95、33.63 及6.50 倍（t=5.84、11.16、9.79、8.72，均P＜0.05），其中act-sgRNA3 組的上調作用最顯著（圖2A）。Pyrosequencing 結果表明相對于對照組，實驗組的甲基化水平平均下降了22.21%（t=6.65，P＜0.05）（圖2B、2C）。

在SiHa 細胞中act-sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4及sgRNA 共轉染（sgRNA1+2+3+4）組的PAX1 表達相對于對照組分別增加了13.35、19.62、3.43 及5.29 倍（t=3.76、6.34、4.53、14.96，均P＜0.05）（圖2D），其中act-sgRNA3 組上調最明顯。定量檢測PAX1 基因甲基化水平后，其甲基化水平平均下降了19.62%（t=17.00，P＜0.05）（圖2E、2F）。

圖2 基于dCas9-Tet1 靶向降低PAX1 基因啟動子甲基化水平Fig 2 Targeted downregulated of the promter of PAX1 methylation based on dCas9-Tet1

2.3 脫靶效應驗證 通過在線工具COSMID 預測調控效果最為明顯的act-sgRNA3 實驗組存在的脫靶基因，并選擇Top 5 基因：FNTA、ARAP1、NEDD4、ILDR2 和KHK。其RT-PCR 結果表明，相對于對照組，CaSki 細胞中FNTA 基因表達上調了1.38 倍（t=8.68，P＜0.05），SiHa 細胞中APAR1、NEDD4 基因分別是對照組的0.79、0.85 倍（t=5.00、9.41，P＜0.05），其他未見顯著變化，見圖3。

圖3 對dCas9-Tet1+act-sgRNA3 組合的脫靶效應檢測Fig 3 Detection of off-target effect of dCas9-Tet1 and act-sgRNA3

3 討論

宮頸癌是最常見的女性癌癥之一，我國宮頸癌發病率占全球發病率的20.2%，并以每年10.5% 的速率增長，而且逐步年輕化，嚴重威脅我國女性的健康[18]。既往研究表明，PAX1 基因高甲基化與宮頸癌之間存在密切的聯系[19]。其甲基化程度在宮頸癌不同病變時期中存在差異，在早期對指導宮頸癌患者進行特異性治療有一定臨床作用。靶向調控PAX1 基因甲基化水平為后期宮頸癌的精準治療提供了思路。目前，美國食品與藥品監督管理局（FDA）已批準了DNA 甲基化抑制劑如5-Aza-2-deoxycytidine（5'-Aza）等藥物應用于敗血病和淋巴瘤患者的治療[20]，但該類藥物存在易獲得耐藥，在實體瘤中療效較差，且缺乏特異性等諸多缺陷[21]。Zhang 等[22]亦發現在宮頸癌細胞中敲低DNA 甲基化轉移酶DNMT1，雖可降低PAX1 基因的甲基化水平，增加其表達，但其特異性較差，其他基因亦被調控。

近來，有研究嘗試利用CRISPR-dCas9-Tet1/DNMT3a 工具特異性調控Tau、TRIM58 基因的甲基化水平，從而為阿爾茲海默病[23]、腎透明細胞癌[24]等疾病的靶向治療提供了新的思路。然而，在宮頸癌領域還未見報道，因此，本研究首次采用CRISPR 技術成功構建了激活PAX1 內源性表達的靶向基因甲基化的調控系統，為后續研究奠定了理論和實驗基礎。

DNA 甲基化主要發生在堿基胞嘧啶第5 位碳原子上，稱為5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）[25]。研究發現，DNA 甲基化是可逆且呈動態變化的，主要由DNA 甲基化轉移酶（DNMTs）和羥甲基化酶（Tets）動態調節[26]。DNMT1 和DNMT3A/3B 分別負責DNA 甲基化的建立和維持，而Tet 蛋白通過連續氧化將5-mC 轉化為5-羥甲基胞嘧啶進而5-甲?；奏ぴ俣?-羧基胞嘧啶，然后被胸腺嘧啶DNA 糖基化酶（TDG）識別并消化，從而實現DNA 去甲基化[27]。Zhang 等[22]發現在宮頸癌細胞系HeLa 及SiHa 細胞中直接敲除DNMT1 后PAX1 的基因表達則分別是對照組的4.98、2.88 倍。而本研究將具有催化活性的Tet1 融合到dCas9 上，在特異性sgRNA 指導下，靶向PAX1 基因啟動子區域進行去甲基化調控。結果表明，在CaSki 及SiHa 細胞中，單一act-sgRNA3 組有效的降低了PAX1 基因的甲基化水平，在CaSki 及SiHa 細胞中甲基化平均水平均降低。由此可見，本研究構建的CRISPR 系統的基因靶向干擾技術具有較高的調控效能。

此外，由于CRISPR 的脫靶效應一直是人們關注的問題，脫靶效應在治療時可能對非靶向基因造成影響，帶來不可預控的嚴重后果。既往研究表明提高sgRNA 的特異性可有效降低CRISPR 的脫靶效應[28-29]。Liu 等[30]發現，靶向啟動子可設計特異性更高的sgRNA 并減少dCas9-Tet1 的潛在脫靶結合。因此，本研究通過CRISPR-ERA 在線工具，選擇靶向于PAX1 基因啟動子區域且特異性評分較高的sgRNA，最大程度減少CRISPR 系統的脫靶效應。目前檢測CRISPR 脫靶效應的方法主要有模擬計算預測和基礎研究實驗方法[31]。本研究則結合計算預測和實驗驗證，通過COMSID 工具預測了act-sgRNA3的脫靶基因，并對act-sgRNA3 的脫靶效應進行了實驗驗證。結果表明，與對照組相比，實驗組中脫靶基因的表達差異均小于2 倍，明顯低于靶基因PAX1 上調的倍數，證明了本研究所用系統的脫靶效應較小。

CRISPR 甲基化調控系統在特異性的降低基因啟動子甲基化水平的同時，可激活靶基因內源性的表達。既往研究發現，內源性基因表達具有獨特的轉錄組和內源性表達水平[32]。根據UCSC（https：//genome.ucsc.edu/），PAX1 基因具有3 種異構體和各種單核苷酸多態性（SNPs）。不同的SNPs 在神經嵴發育和青少年特發性脊柱側凸中發揮不同的作用[33]。因此，激活內源性PAX1 表達對于觀察細胞內部的真實情況是必要的。通過CRISPR 基因編輯技術內源性調控靶基因的表達，在精確治療方面有很大的潛力。

綜上所述，對宮頸癌中PAX1 基因的甲基化進行調控可有效地改變其表達水平。本研究建立的靶向PAX1 基因甲基化調控的工具對今后宮頸癌的靶向治療具有重要的意義和價值。本課題組也將基于上述甲基化調控系統對PAX1 基因甲基化機制繼續開展實驗研究，為后續PAX1 甲基化對宮頸癌治療潛力的挖掘奠定基礎。