CD155 依賴m6A 修飾調控宮頸癌細胞的惡性行為

祁小珍，石立瑩

（天津醫科大學基礎醫學院病原生物學教研室 天津 300070）

宮頸癌與乳腺癌、結直腸癌和肺癌是全球女性四大常見癌癥[1]。近幾十年研究表明，表觀遺傳學中RNA 轉錄組學在癌癥中發揮重要作用[2-3]。

N6-甲基腺苷（m6A）作為真核信使RNA 中最豐富的修飾，在生物的各種進程中發揮關鍵性作用，其甲基化轉移酶復合物由METTL3、METTL14、WTAP、RBM15 和KIAA1429 等組成[4]。其中METTL3 是甲基化轉移酶復合物中起主要作用的催化亞基。最近的研究顯示，METTL3 與宮頸癌的惡性行為及不良預后相關[5]。YTHDF1 屬于YTH 結構域蛋白家族，是識別m6A 修飾位點重要的閱讀器（Reader），主要功能是識別RNA 上m6A 修飾位點，增強RNA的穩定性及提高RNA 翻譯效率。

脊髓灰質炎病毒受體CD155（PVR）在多數正常組織中低表達而在癌組織中高表達，如結腸癌、肺腺癌、黑色素瘤和胰腺癌等[6-9]。最近有文章報道，CD155 的異常表達與宮頸癌的惡性行為和不良預后相關，但CD155 在宮頸癌細胞中異常表達的調控機制還有待研究。因此，本文從轉錄組的方向出發，初步探究在宮頸癌細胞中CD155 mRNA 甲基化后的表達調控機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養和細胞轉染 人宮頸癌細胞HeLa 和S12 細胞均購買于ATCC 細胞庫，HeLa 細胞培養液是含有6%胎牛血清（FBS）、100 μg/mL 鏈霉素和100 IU/mL 青霉素的RPMI1640（Gibco），細胞培養在37℃、5%CO2的培養箱中，在細胞密度達到80%時進行傳代培養。取對數生長期細胞，以1×105個/mL密度接種至24 孔板，每孔加入250 μL 無血清培養基。在細胞密度達到70%～80%時，參照脂質體2000試劑使用說明進行轉染。

1.2 質粒的構建 分別構建CD155 過表達質粒pCNAD3-Flag/CD155 和敲降質粒pSilencer-shR/CD155（pshR-CD155），其對照組分別是PCDNA3-Flag 和pSilencer-NC，構建質質粒所用引物見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3 Western 印跡實驗 HeLa 細胞轉染過表達和敲降CD155 質粒及其對照質粒48 h 后，RIPA 裂解細胞制備蛋白樣品，將蛋白樣品在10%的SDSPAGE 膠上電泳分離后，轉移至甲醇預先激活的PVDF 膜上，5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，一抗Anti-Ecad 4℃孵育過夜，TBST 洗膜4 次，二抗羊抗兔在常溫孵育2 h，TBST 洗膜4 次，加入發光液室溫孵育1 min 后，進入暗室曝片，根據條帶深淺選擇合適的曝光時間。

1.4 細胞增殖和克隆實驗 按預定分組轉染細胞，24 h 后將細胞以6×103個/mL 的密度接種到96 孔板中，每個組設置5 個復孔，分別培養24、48、72 h后向每個孔中加入10 μL MTT，6 h 后吸棄MTT 后加入100 μL DMSO，搖床震蕩10 min 后使用酶標儀檢測490 nm 和570 nm 處每個孔的光密度（OD）值，進行3 次獨立重復實驗后取平均值進行t 檢驗分析?？寺⌒纬蓪嶒烆A實驗后，細胞消化計數，將5×102個細胞接種到12 孔板中，每個分組3 個復孔，在完全培養液中培養14 d，然后棄去培養液，使用結晶紫染色10 min，沖洗干凈后進行計數，使用Image J 計數并進行分析。

1.5 細胞的遷移實驗 細胞轉染24 h 后，消化收集細胞，取6×104個細胞，離心后棄凈培養液，使用200 μL 無血清培養液重懸后加入小室的上方，同時在小室下方的培養板里加入800 μL 10%的1640完全培養液。放入37℃、5%CO2的培養箱中，36 h 后棄去上層液體，加入甲醇固定，室溫固定30 min 后棄去甲醇，在結晶紫中染10 min，沖洗干凈，用棉簽擦去上室表面的殘余細胞，晾干后取出膜，用中性樹脂封片并晾干，在正置顯微鏡下計數細胞，隨機照取5 張圖片，計數遷移細胞數目。

1.6 細胞侵襲實驗 將50 μL Matrigel 基質膠加入300 μL 無血清1640 培養基中充分吹打混勻，取50 μL 混合液平鋪在小室內，4℃放置30 min，37℃、5%CO2的培養箱放置過夜，取8×104個細胞，離心后棄凈培養液，使用200 μL 無血清培養液重懸后加入小室的上方，同時在小室下方的培養板里加入800 μL含10%血清的1640 完全培養液。放入37℃、5%CO2的培養箱中，36 h 后棄去上層液體，加入甲醇，室溫固定30 min，棄去甲醇，在結晶紫中染10 min，沖洗干凈，用棉簽擦去上室表面的殘余細胞，晾干后取出膜，用中性樹脂封片并晾干，正置顯微鏡下觀察，隨機照取3 張圖片，計數侵襲細胞數目。

1.7 RNA 免疫共沉淀實驗和實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）使用RIP 試劑盒，按照說明書進行實驗，得到3 組產物：總RNA（input-RNA）、m6A 抗體特異性捕獲的CD155RNA（m6A-ip-RNA）、IgG 抗體吸附的非特異性RNA（IgG-ip-RNA）。Nanopdrop2000 測定RNA 濃度后，進行qRT-PCR，計算3 組中CD155 表達的相對定量，實驗重復3 次。

使用TRIzol 試劑提取細胞及其他轉染組細胞的總RNA，使用Nanodrop 2000 測定RNA 濃度以及OD260/OD280 的比值，將RNA 逆轉錄成cDNA 進行實驗，同時做3 個復孔取平均值，以β-actin 為內參，以2-△△Ct計算CD155 表達的相對定量，實驗重復3 次，RT-qPCR 所用引物如表2。

表2 qRT-PCR 引物Tab 2 qRT-PCR primers

1.8 生物信息學網站 KM-Plotter（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service）、TCGA（http://www.cbioportal.org/）預測CD155 的預后，GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）預測宮頸癌組織中CD155的表達情況，m6ATarget [m6A2Target（canceromics.org）]數據庫在線預測CD155 的識別者。

1.9 統計學處理 采用GraphPad Prism 和ImageJ軟件對所得3 次重復數據進行分析和作圖，數據均符合正態分布，采用t 檢驗進行統計分析，P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD155 在宮頸癌中呈現高表達 與癌旁組織相比，宮頸癌組織中的CD155 有較高水平（圖1A），并且高水平的CD155 表達與宮頸癌不良預后相關（圖1B、1C）。在宮頸癌和非宮頸癌細胞系中進行RT-qPCR，檢測CD155 的RNA 水平。結果顯示，相比于非宮頸癌永生細胞S12，宮頸癌細胞系HeLa、C33A 中CD155 有較高水平的表達（t=3.749，P＜0.05），見圖1D。

圖1 CD155 在宮頸癌組織和細胞中的表達情況Fig 1 Expression of CD155 in cervical cancer tissues and cells

2.2 CD155 提高HeLa 細胞存活率，使細胞克隆形成增加 Western 印跡實驗證明，CD155 過表達質粒pCD3-Flag/CD155 和CD155 敲降質粒pshRCD155 1＃和pshR-CD155 2＃是有效的（圖2A、2B）。選取效果最好的敲降質粒pshR-CD155 2＃進行接下來的實驗。過表達CD155 或者敲降CD155 后，與對照組相比，細胞存活率表現為升高或降低（圖2C，t=3.152，P＜0.05）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，過表達或敲降CD155 后，細胞增殖能力增強或減弱（圖2D，t=3.706，P＜0.05）。

圖2 CD155 對HeLa 細胞生長和增殖能力的影響Fig 2 The effect of CD155 on the growth and proliferation of HeLa cells

2.3 CD155 增強HeLa 細胞的遷移和侵襲能力，促進HeLa 細胞的EMT 進程 過表達或敲降CD155質粒轉染細胞后，進行小室遷移實驗，結果顯示，與對照組相比，轉染過表達CD155 質粒后細胞的遷移能力增強，敲降CD155 后與對照組相比，細胞的遷移能力減弱（圖3A，t=5.422，P＜0.01）。在鋪設matrigel的小室內進行小室遷移實驗，與對照組相比，過表達CD155 后穿過小室的細胞增多，敲降CD155 后穿膜細胞相對減少（圖3B，t=3.599，P＜0.05）。過表達CD155 后，E-cad 表達降低，Vimentin 表達升高，敲降CD155，E-cad 表達升高，Vimentin 表達降低（圖3C，t=3.599，P＜0.05）。

圖3 CD155 對HeLa 細胞遷移、侵襲能力和細胞EMT 進程的影響Fig 3 The effect of CD155 on HeLa cell migration,invasion ability and cellular EMT process

2.4 宮頸癌細胞中CD155 的表達受m6A 修飾調控敲降METTL3 質粒和它的對照質粒轉入HeLa 細胞中，之后進行MeRIP-RT-qPCR 實驗，與對照組相比，敲降METTL3 后免疫沉淀物中的CD155 RNA 的富集明顯減少（圖4A）。當METTL3 過表達或敲降時，CD155 的RNA（t=6.725，P＜0.05）和蛋白水平也隨之升高或降低（圖4B、4C）。敲降METTL3 后，CD155RNA 的半衰期降低（圖4D，t=5.622、6.063、5.857，均P＜0.05）。

圖4 宮頸癌細胞中CD155 的表達受m6A 修飾調控的驗證Fig 4 Verification that the expression of CD155 in cervical cancer cells is regulated by m6A modification

2.5 CD155 甲基化后Reader 的鑒定 結果顯示，CD155 甲基化后的閱讀器可能是YTHDF1 和YTHDF3（圖5A），與對照組相比，YTHDF1 比YTHDF3 明顯促進了CD155 蛋白的表達（圖5B）。與對照組相比，過表達或敲降YTHDF1，CD155 蛋白的表達隨之增加或減少（圖5C）。與對照組相比，敲降YTHDF1 后細胞中CD155RNA 的半衰期呈現降低趨勢（圖5D，t=10.93、5.602、4.359，均P＜0.05）。pCD3-Flag/YTHDF1 和pCD3-Flag/YTHDF1mut 質粒都是有效的（圖5E），進行RIP-RT-qPCR 實驗，結果顯示，和對照組相比，YTHDF1 組有效富集了CD155 的RNA（t=4.686，P＜0.01），但YTHDF1 mut組中CD155RNA 的富集程度不如YTHDF1 組（圖5F，t=4.462，P＜0.05）。

圖5 CD155 甲基化后Reader 的鑒定Fig 5 Identification of Reader after CD155 methylation

3 討論

m6A 的異常修飾在腫瘤進程中有著重要的作用，m6A 修飾參與肝癌和乳腺癌等的遷移侵襲進程[10-12]。m6A 修飾也參與乳腺癌與子宮內膜癌等的增殖進程[13-14]。宮頸癌的相關發病機制是一個非常復雜和多種因素相互作用的結果，研究表明CD155可以作為宮頸癌不良預后的指標[15]。本研究發現了一個有意義的機制，即m6A 可能與CD155 一起參與宮頸癌的發病機制。

目前有研究顯示CD155 在多種腫瘤中高表達并且促進腫瘤的惡性行為，例如CD155 在肺腺癌、卵巢癌和膠質瘤等癌癥中表達異常升高[16-18]。本實驗證明CD155 促進宮頸癌細胞的惡性行為，這與目前CD155 與腫瘤關系的研究結果一致。METTL3 在宮頸癌中的作用在目前的文獻中說法不一，有的文獻顯示宮頸癌中METTL3 的表達升高并且抑制癌癥的進程[19]，有的文獻顯示METTL3 的表達升高并促進宮頸癌的進程[20-21]。本研究結果表明宮頸癌細胞中METTL3 表達較高。

為了探究CD155 在轉錄水平上的調控機制，實驗證明METTL3 使CD155RNA 上的甲基化修飾增加，敲降METTL3 后Western 印跡和RT-qPCR 結果顯示CD155RNA 的翻譯效率降低，CD155RNA 穩定性降低。本研究結果表明METTL3 使CD155RNA的m6A 修飾增加，進而促進CD155 的表達和增強CD155 的穩定性。目前的研究表明，RNA 被m6A 修飾后，有不同閱讀器識別相應的m6A 位點，決定RNA 的穩定性以及翻譯效率[22]。本研究通過預測及實驗證明CD155 的閱讀器是YTHDF1，并且YTHDF1 依賴m6A 修飾位點促進CD155 的表達，這種模式符合m6A 修飾調控方式。最后通過挽救實驗進一步證明METTL3 通過調控CD155 的表達，促進宮頸癌細胞的惡性行為。

總之，本研究說明了METTL3 能夠使CD155 RNA上的m6A 甲基化修飾增加，進而有YTHDF1 識別m6A甲基化位點促進CD155 的表達。未來還可以通過測序進一步找出CD155RNA 上的甲基化修飾位點。