機械加載通過促進髕下脂肪墊干細胞遷移及軟骨分化治療骨關節炎

王筱郁，李杰，2，李心樂，2，劉大全，2，張平，2，3

（1.天津醫科大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，天津 300070；2.衛生部激素與發育重點實驗室，天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300134；3.天津市脊柱脊髓重點實驗室，天津 300052）

骨關節炎（OA）是一種以關節軟骨退行性病變為主要特征的慢性疾病[1]，它引起的關節疼痛、運動功能障礙，帶來了沉重的社會負擔[2]。目前的藥物治療（如非甾體抗炎藥和阿片類藥物）在延緩OA 的同時也會導致嚴重的不良反應[3]。近年來，間充質干細胞（MSCs）在關節軟骨重建中的修復作用越來越受到重視[4]。在關節內或關節周圍的多個干細胞龕中存在各種具有遷移潛能的MSCs[5]。在早期OA 生物力學作用下，這些能夠到達軟骨淺層的關節內MSCs是軟骨修復的關鍵細胞[6]。

髕下脂肪墊（IFP）是一種位于關節囊內、滑膜外的脂肪組織[7]，其中含有增殖能力很強的MSCs[8]。并且，胚胎起源決定了其擁有更強的軟骨分化潛能[9]，這些MSCs 可以遷移至軟骨表面進行修復[10]。機械加載是一種低頻率、強度小、作用于膝關節等滑膜關節的溫和機械刺激，能模擬人體主動運動的物理治療手段[11]，可以通過抑制炎性、促進骨髓MSCs 軟骨分化，促進血管形成、骨形成，分別用于OA[12]、骨質疏松[13]、股骨頭壞死[14]的治療。前期的工作已經發現機械加載通過OA 小鼠的骨-軟骨串擾來防止軟骨退化[15]，但是機械加載對髕下脂肪墊干細胞（IFPSCs）的動員作用尚不清楚。本實驗采用手術橫斷小鼠膝關節內側副韌帶和切除內側半月板建立OA 模型，評估機械加載對IFP-SCs 遷移和軟骨分化的影響，為物理治療OA 和內源性軟骨再生提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 54 只SPF 級雌性C57BL/6 小鼠，約14 周齡，體重18～20 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供[生產許可證號：SCXK（京）2014-0013]。每籠5 只小鼠，自由攝取飼料和水。所有實驗根據天津醫科大學實驗動物管理規定進行，并經天津醫科大學倫理委員會批準，審批號為［SYXK（津）2019-0004］。

1.1.2 主要儀器和試劑 石蠟切片機（RM255）購自德國Leica 公司。光學顯微鏡BX53 購自日本Olympus 公司。轉化生長因子（TGF）-β3 購自中國Novoprotein 公司。HE、番紅O、Alcian Blue 染料購自美國Sigma 公司。胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶購自美國Invitrogen 公司。抗體購自美國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及手術造模 54 只小鼠采用隨機數字表法分成為對照組（Sham 組，n=18）、OA 組（n=18）、骨關節炎機械加載組（OAL 組，n=18）。用1.5%異氟烷麻醉小鼠，于右下肢膝關節內側打開關節腔，使用手術顯微鏡和顯微外科技術橫斷內側副韌帶，摘除內側半月板。在右膝手術結束后，對左膝進行了同樣的手術。Sham 組只切開關節內側皮膚。術后使用丁丙諾啡鹽酸鹽鎮痛并使用恩氟沙星抗感染3 d。

1.2.2 機械加載治療 手術造模后第2 天，OAL 組接受機械加載。在機械加載期間，小鼠經1.5%異氟烷吸入麻醉，用定制的機械加載裝備對雙側膝關節施加相同負荷（圖1）。應用1 N 和5 Hz 的機械加載治療2 周，每天6 min（每側腿各3 min）。Sham 組和OA 組僅放置在加載裝置上，沒有實施加載力。加載后，允許小鼠在籠子中正常活動。

圖1 機械加載示意圖Fig 1 Schematic diagram of mechanical loading for a mouse

1.2.3 組織學分析

1.2.3.1 組織處理：小鼠在手術后2 周處死。剝離小鼠后腿，剔除皮膚、軟組織及韌帶，保留完整膝關節。將組織在10%中性福爾馬林中固定2 d 后，在14%的EDTA 中脫鈣2 周。將組織用石蠟包埋，冠狀位切片，厚度為5 μm。

1.2.3.2 HE、番紅O/快綠染色：組織切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，進行HE 和番紅O/快綠染色，脫水透明后樹膠封片，顯微鏡下觀察組織病理形態學改變。使用Olympus CCD DP73 軟件進行相關數據的測量。軟骨國際骨關節炎研究學會（OARSI）評分評估軟骨損害程度。

1.2.3.3 免疫熒光：組織石蠟切片用10%的山羊血清封閉，用一抗4°C 過夜孵育SDF-1（1∶1 000）、然后用熒光二抗染色。細胞核用DAPI 染色。使用U-RFL-T 熒光顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）獲得圖像。計數每個樣本中陽性染色細胞的數量。

1.2.4 細胞學實驗

1.2.4.1 細胞分離培養：人道主義處死小鼠后，分離其后腿，切開關節囊上方皮膚，在髕韌帶（PL）旁做切口，翻開PL，下方淡黃色組織即為IFP。用0.2%Ⅰ型膠原酶震蕩消化IFP 1 h，用70 μm 細胞篩濾去多余脂肪組織。由于小鼠的IFP 體積很小，為了得到足夠數量的原代細胞，每組使用9 只小鼠，將同一分組的3 只小鼠種在一個孔板。IFP-SCs 在添加100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素和10%胎牛血清（FBS）的DMEM 中培養（圖2）。

圖2 IFP 的提取及光鏡下IFP-SCs 的形態（×100）Fig 2 Extraction of IFP and the morphology of IFP-SCs under light microscopy（×100）

1.2.4.2 細胞遷移實驗：Transwell（8 μm，24 孔板）用于細胞遷移實驗。IFP-SCs 懸浮在上室無血清的培養基中，下室含有含10% FBS 的DMEM。共培養12 h 后，用福爾馬林固定細胞，結晶紫染色通過孔膜底部的細胞以評估細胞遷移。

1.2.4.3 軟骨誘導實驗：IFP-SCs 在軟骨分化培養基中（MesenCult 增殖試劑盒補充10-8mol/L 地塞米松、50 μg/mL 抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸和10 ng/mL TGF-β3）培養28 d。細胞在10%緩沖福爾馬林中固定，PBS 洗滌后，用1%阿立新藍染色，藍染的細胞為軟骨細胞。

1.2.5 Western 印跡 IFP-SCs 在PBS 中洗滌3 次，在RIPA 裂解緩沖液中提取總蛋白。在4°C 下離心10 min 去除細胞碎片。采用一抗CXCR4（1∶1 000）、SOX9（1∶10 000）和β-actin（1∶10 000）在4°C 過夜孵育。二抗室溫（1∶10 000）孵育90 min 后，經化學發光后用凝膠成像系統檢測相關蛋白的表達。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。實驗相關數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較行LSD-t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 機械加載對OA 關節軟骨的影響 HE 染色和番紅O 染色顯示，Sham 組軟骨表面光滑、完整，而OA組軟骨表面粗糙、不平，OARSI 評分升高（t=-8.485，P＜0.001）。經過機械加載治療后，軟骨表面平整，OARSI 評分降低（t=4.025，P＜0.01）。另外，與Sham組相比，OA 組的軟骨細胞數量減低，空泡細胞數目增多，而機械加載使軟骨細胞有所增加（t=24.405、-9.605，均P＜0.001），空泡細胞有所減低（t=-8.000、-3.674，均P＜0.01，圖3）。

圖3 內側脛骨平臺軟骨的HE 和番紅O 染色形態學檢查（×400）Fig 3 Morphological examination of the medial tibial plateau cartilage by HE and Safranine O staining（×400）

2.2 機械加載促進了歸巢因子SDF-1 的表達和IFP-SCs 的遷移 免疫熒光結果顯示，與Sham 組相比，OA 組SDF-1 表達有所增加，機械加載治療后，OA 小鼠軟骨中SDF-1 的表達進一步增加（t=-8.148、-6.695，均P＜0.001，圖4）。同時，細胞遷移實驗表明，與Sham 組相比，OA 組的細胞遷移量增加（t=-5.085，P＜0.05），OAL 組的細胞遷移水平最高（t=-5.142，P＜0.001，圖5）。進一步通過Western 印跡檢測遷移相關蛋白的水平。結果顯示，與Sham 組相比，OA 組CXCR4 蛋白表達水平升高（t=-9.679，P＜0.001），機械加載進一步增強了其蛋白的表達水平（t=-4.403，P＜0.01，圖6）。

圖4 各組小鼠軟骨中SDF-1 的表達（×100）Fig 4 The expression of SDF-1 in cartilage of mice in each group（×100）

圖5 各組IFP-SCs 遷移（×100）Fig 5 Migration of IFP-SCs in each group（×100）

圖6 Western 印跡檢測各組CXCR4 表達Fig 6 The expression of CXCR4 detected by Western blotting assay in each group

2.3 機械加載上調SOX9 促進IFP-SCs 軟骨分化 通過軟骨誘導實驗，檢測機械加載對IFP-SCs軟骨分化的影響。與Sham 組相比，OA 組中分化的軟骨細胞數量明顯減少。然而，OAL 組IFP-SCs 分化為軟骨細胞的數量顯著增加（t=28.517、-10.462，均P＜0.001，圖7）。為了進一步探究軟骨分化的機制，采用Western 印跡檢測IFP-SCs 中的SOX9，與Sham 組相比，OA 組的SOX9 蛋白表達水平顯著降低，而機械加載升高了IFP-SCs 中SOX9 蛋白表達水平（t=17.580、-11.170，均P＜0.01，圖8）。

圖7 各組IFP-SCs 誘導的軟骨細胞（×100）Fig 7 Chondrocytes induced from IFP-SCs in each group（×100）

圖8 Western 印跡檢測各組SOX9 表達Fig 8 The expression of SOX9 detected by Western blotting assay in each group

3 討論

OA 是一種常見的關節軟骨退行性疾病，由于肥胖、衰老等因素不斷增加，其發病率也在逐年升高。因為關節軟骨沒有血管，一經損傷后軟骨難以修復，隨著疾病的進展，會引起關節疼痛、僵硬甚至運動障礙，嚴重影響生活質量。目前，OA 已成為重要的公共健康問題之一[16]。因此，迫切需要開發OA早期的治療辦法以預防疾病進展。

早期藥物治療往往伴隨一定的不良反應，相比于藥物，運動訓練更適合早期OA。適度運動不僅能降低體重過高等危險因素，更能預防OA 的發生發展。機械加載作為一種可模擬主動運動的被動物理康復治療方式，能夠引起骨髓腔內壓力的改變，驅動骨質內液體的流動，動員內源性干細胞，影響骨髓中的干細胞的分化、功能和歸巢，調節骨髓內微環境[11]。許多研究證明了機械加載對骨骼、關節的有益作用[17-19]。其中包括機械加載通過增強自噬、促進骨髓干細胞軟骨分化[12]、抑制炎性反應[20]，以及抑制破骨細胞[15]發揮作用，達到延緩OA 進展的目的[12]。本實驗拓展了之前的研究范圍，以關節內的脂肪組織為研究對象，探究機械加載條件下關節內干細胞的動員機制。筆者提取了OA 小鼠的IFP-SCs，證明了機械加載通過增強IFP-SCs 遷移及軟骨分化能力，延緩OA 軟骨破壞。OA 這種結果趨勢與筆者預期一致，也與所報道的力學刺激對OA 的有益作用相一致。本實驗證明了膝關節機械加載這種力學刺激方式對關節內干細胞的動員作用，以及對OA 關節軟骨的保護及治療作用。

IFP-SCs 在組織損傷后，干細胞的有效動員對其修復至關重要[21]。研究表明，IFP-SCs 可以遷移到滑液中，修復受損的軟骨[5]。SDF-1 通過與其受體CXCR4 發生反應，調節干細胞歸巢到損傷部位[22]。事實上，損傷后組織中趨化因子SDF-1 濃度增加在短時間內是有限的，在此期間，MSCs 雖然可以動員到損傷部位，但數量不足。研究發現，低強度機械刺激可以通過SDF-1/CXCR4 軸，促進MSCs 遷移[23-24]。在本研究中，與OA 組相比，機械加載增加了軟骨表面SDF-1 的表達。Western 印跡結果顯示，機械加載增加了IFP-SCs 中CXCR4 的表達。細胞遷移實驗顯示，IFP-SCs 在機械加載后遷移能力增強。以上結果表明，機械加載可能通過SDF-1/CXCR4 軸，促進IFPSCs 遷移，修復軟骨。

另外，在軟骨的形成和穩定性中，SOX9 是不可或缺的，特別是在MSCs 的軟骨分化中[25-26]。文獻表明，軟骨修復失敗的潛在機制之一是OA 關節中的軟骨細胞祖細胞和MSCs 缺乏軟骨生成轉錄因子SOX9 的活性[27]。本實驗研究結果表明，在OA 小鼠中SOX9 的表達水平明顯降低，而機械加載上調了IFP-SCs 中SOX9 的表達，并促進其軟骨分化。這與低強度機械刺激可促進IFP-SCs 分化為軟骨細胞結果相一致[28]。實驗證明了機械加載作用下SOX9 對IFP-SCs 成軟骨分化的貢獻。

綜上所述，本研究表明機械加載可以作為OA 的一種新的治療方法。機械加載可能通過激活SDF-1/CXCR4 軸、促進SOX9 表達，增強IFP-SCs 的遷移和軟骨分化能力，發揮其治療作用。但機械加載治療下的遷移方式仍不明確，需進一步完善體內外研究進行驗證，為臨床治療OA 提供新的思路依據。