梅毒螺旋體TP17 蛋白B 細胞表位研究

劉晶晶，陳玉梅，潘衛東

（1.鄭州大學基礎醫學院，鄭州 450001；2.西華縣人民醫院檢驗科，周口 466000；3.鄭州大學生命科學學院，鄭州 450001）

TP 基因組全長1 138 006 bp，含1 041 個開放閱讀框，毒力因子包括12 個膜蛋白家族和一些溶血素[6]。膜蛋白是TP 的主要抗原蛋白，對TP 的免疫學診斷和疫苗研究具有重要意義，主要包括TP47（TP0574）、TP15（TP0171）、TP17（TP0435）、TP34（TP0971）及GlpQ（TP0257）等[7]。TP47（TP0574）是第一個被證明是脂質修飾的TP 膜蛋白，是一種青霉素結合蛋白[8]。TP17 蛋白位于TP 細胞外膜，是一種分子量為16.5 kD 的膜脂蛋白，約占TP 可溶性蛋白的2%，具有較強的免疫原性[9-10]。有研究顯示，以TP17蛋白為抗原的免疫學診斷試劑敏感性可以達到98%，特異性達到99%，在梅毒感染的血清學診斷中具有重要的價值[11-12]。TP17 蛋白是梅毒的主要抗原蛋白，關于TP17 蛋白抗原表位的研究報道較少，確定TP17 蛋白B 細胞表位，對TP 的免疫學診斷和疫苗設計具有重要意義。本研究提出通過生物信息學技術對TP17 蛋白的結構、免疫學特征和B 細胞表位等進行預測，建立TP17 多肽的酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測法，評價多肽與臨床TP 陽性血清的反應性，驗證TP17 蛋白抗原B 細胞表位預測的準確性及表位多肽用于梅毒臨床檢驗的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 梅毒陽性病例血清樣品10 份（西華縣人民醫院），梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒-酶聯免疫法（廈門英科新創公司），重組TP17 蛋白（中國近岸生物公司），TP17 多肽（委托上海生工公司合成），HRP 標記的羊抗人IgG（英國Abcam 公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 TP17 蛋白生物學特征分析 從美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）蛋白質數據庫中獲得TP17 蛋白的氨基酸序列（Genebank No.ADR64315.1），以SignalP-5.0 及TMHMM Server v.2.0 軟件預測蛋白信號肽及跨膜區氨基酸序列；利用NetNGlyc-1.0、NetOGlyc 4.0 預測TP17 蛋白N 型和O 型糖基化位點；利用ExPASy 數據庫預測蛋白分子量和等電點，見表1。

1.2.2 TP17 蛋白線性 B 細胞表位預測用DNASTAR 的Protean 軟件及在線預測軟件SOPMA 預測TP17 蛋白的二級結構（Secondary structure），分析α螺旋、β 折疊、轉角及無規卷曲等二級結構元件的分布情況[13-14]。綜合利用IEDB 數據庫B 細胞表位相關分析軟件（BepiPred-2.0、BepiPred 等）、SOPMA 以及DNASTAR 等軟件對TP17 蛋白進行系統性分析，預測其抗原性（antigenicity）、表面可及性（accessibility）、可塑性（flexibility）、親水性（hydrophilicity）等特征，預測線性B 細胞表位[15-16]。采用SWISS-MODEL同源建模分析TP17 蛋白的三維結構及B 細胞表位在三維結構中的定位，結合IEDB 數據庫Disco-Tope：Structure-based Antibody Prediction 軟件分析TP17 蛋白的構象型B 細胞表位[17]，見表1。

表1 生物信息學數據庫及分析工具Tab 1 Bioinformatics database and analysis tools

1.2.3 TP17 重疊多肽的分段合成 將TP17 蛋白分成6 段（Tp17-1～Tp17-6），臨近兩條多肽之間設置10 個氨基酸的重復（表2）。委托上海生工公司合成多肽小分子并進行HPLC-MS 鑒定。

表2 T17 蛋白重疊多肽氨基酸序列Tab 2 Amino acid sequence of overlapping polypeptide of T17 protein

1.2.4 TP17 重疊多肽的耦聯 參考文獻[19]方法，采用碳二亞胺法（EDC）分別將6 段多肽與BSA 耦聯，制備包被抗原，采用SDS-PAGE 鑒定多肽耦聯效果。

1.2.5 TP17 蛋白抗原性檢測 采用ELSIA 測定TP17 蛋白的抗原性。以碳酸鹽緩沖液（CBS，PH 9.0）稀釋TP17 蛋白至2 μg/mL，加入96孔ELISA板，50 μL/孔，4℃靜置16 h；以含0.05%吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution-twain，PBST）洗滌3 次，加入5%的脫脂奶300 μL/孔，37℃靜置2 h；再以PBST 洗滌6 次，隨后向檢測孔中加入1∶200 稀釋的梅毒螺旋體陽性患者血清樣本，對照孔分別加入1∶500 稀釋的陽性或陰性標準血清。37℃溫箱孵育30 min，以PBST洗滌6 次，再加入1∶2 000 稀釋的HRP 標記的羊抗人IgG，孵育30 min。PBST 洗滌6 次后加入顯色液，以2 mol/L H2SO4反應終止反應，讀取OD450值。結果判定：S/N＞2.1 判為陽性，其中++++為OD450＞0.59，+++為OD450＞0.4，++為OD450＞0.3；+為S/N＞2.1 但OD450≤0.3

1.2.6 TP17 重疊多肽抗原性檢測 采用ELSIA 方法檢測6 條BSA 耦聯的TP17 多肽與10 份梅毒陽性患者血清的反應性。以CBS 緩沖液稀釋耦聯多肽抗原至終濃度為2 μg/mL 進行抗原包被，以1∶500稀釋的血清樣品為一抗，1∶2 000 稀釋的HRP 標記的羊抗人IgG 為二抗，進行ELSIA 檢測，檢測及結果判定方法同1.2.4。

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2015年12月因ACS在復旦大學附屬上海市第五人民醫院行冠脈介入治療的患者。入選標準：就診時年齡≥75歲，能配合手術治療；估算腎小球濾過率(eGFR)>30 mL·min-1·1.73 m-2；無出血。排除標準：合并腫瘤等終末期疾病；無法配合術后規則用藥。共入選181例患者，其中男性110例、女性71例，年齡75～89歲。其中，ST段抬高型急性心肌梗死(STEMI )60例，肌鈣蛋白I(TNI)陽性116例，急診冠脈介入治療44例。患者入院時均進行BI評分。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0 統計軟件對本實驗相關數據進行統計分析，組間兩兩比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異顯著具有統計學意義。

2 結果

2.1 TP17 蛋白的生物學特征與二級結構預測 TP17蛋白全長156 個氨基酸殘基，分子量約16.5 kD，理論等電點（pI）8.62；經SignalP-5.0 分析TP17 蛋白N 端22 個aa 為信號肽，信號肽切割位點在Cys22～Val23 之間；TMHMM 2.0 預測TP17 蛋白存在2 個潛在的N-糖基化位點Asn68 和Asn128 和4個O-糖基化位點Thr13、Thr17、Thr19 及Thr21。同源進化分析結果顯示，TP17 蛋白與大腸桿菌的銅抗性脂蛋白NlpE 具有20%的序列同源性，屬于同一進化分支（圖1）。

圖1 TP17 蛋白同源進化分析Fig 1 Homologous evolution analysis of TP17 protein

SOMPA 分析結果顯示TP17 蛋白二級結構無規卷曲（Random coil，c）約占42.31%、α 螺旋（Alpha helix，h）占25.64%、延伸鏈（Extended strand，e）24.36%、β轉角（Beta turn，t）7.69%（圖2）；DNASTAR 中Garnier-Robson 方法和Chou-Fasman 方法預測的TP17 蛋白二級結構中α 螺旋、β 折疊、轉角及無規卷曲區域略有差異（圖2），其中SOMPA 預測的無規卷曲部分與DNASTAR 軟件中的轉向（Turn，Regions）和卷曲（Coil，Regions）部分有重復的區域主要位于：Cys29～Ala35、Gly51～Cys58、Lys82～Thr94、Ser109～Lys119、Gly134～Ala146。

圖2 TP17 蛋白的二級結構預測Fig 2 Prediction of secondary structure of TP17 protein

2.2 TP17 蛋白的線性 B 細胞表位預測DNASTAR 和IEDB 綜合分析預測TP17 蛋白的抗原性、柔韌性、親水性、表面易接近性等（圖3）與B 細胞表位密切相關的結構信息，采用Bepipred 預測TP17蛋白的線性B 細胞表位，Bepipred Linear Epitope PredictionResults2.0（閾值=0.50），獲得4 條線性B 細胞表位：Thr27～Gly47、Gln74～Pro88、Ile102～Ile125、Ala135～Lys152，Bepipred Linear Epitope Prediction Results（閾值=0.35）共獲得7 條線性B細胞表位：Pro30～Glu38、Leu53～Asp62、Thr64、Thr66～Glu74、Lys82～Tyr91、Ser110～Lys119、Tyr132～Met145。

圖3 TP17 蛋白的B 細胞表位預測Fig 3 Prediction of B cell epitopes of TP17 protein

2.3 TP17 蛋白三級結構同源建模及B 細胞表位定位 采用SWISS-MODEL，基于參考模型（PDB：4u3q）生成完整TP17 蛋白三維結構（圖4）。結果顯示，TP17 蛋白富含8 個β-折疊和2 個β-螺旋結構，其β-轉角與二級結構預測結果有一定符合度，最終預測表位區Thr27～Glu38、Leu53～Asp62、Thr66～Gln74、Lys75～Pro88、Leu107～Lys119以及Tyr132～Met145 展示在TP17 蛋白分子表面（圖4），主要位于無規卷曲區和β-折疊片的轉折區域。

圖4 TP17 蛋白的三級結構預測Fig 4 Prediction of three dimensional structure of TP17 protein

2.4 TP17 蛋白構象B 細胞表位預測分析結果如圖5所示，TP17蛋白的氨基酸區域為：Lys34～Ala35、Ala55、Pro88、Glu99、Pro136～Pro147、Thr154，分布于三維結構外側以黃色區域標注。

圖5 TP17 蛋白的構象型B 細胞表位預測Fig 5 Prediction of conformational B cell epitopes of TP17 protein

2.5 TP17 蛋白及其分段多肽的合成及鑒定 SDSPAGE 鑒定結果表明，TP17 蛋白的純度約為95%，濃度為2 g/L，HPLC-MS 檢測結果顯示成功合成的多肽Tp17-1 分子量為3.12 kD、Tp17-2 為3.05 kD、Tp17-3 為3.25 kD、Tp17-4 為3.44 kD、Tp17-5 為3.41 kD、Tp17-6 為3.68 kD。6 段多肽與BSA 耦聯后進行鑒定，SDS-PAGE（圖6）結果顯示6 段多肽均耦聯成功。

圖6 重組表達蛋白TP17 及重疊多肽耦聯物的SDS-PAGE 鑒定Fig 6 Identification of recombinant protein TP17 and overlapping polypeptide conjugates by SDS-PAGE

2.6 臨床陽性血清樣品與TP17 蛋白及多肽的反應 ELISA 檢測結果10 份梅毒陽性的臨床血清均與TP17 蛋白具有良好反應性，OD450值在0.59～1.45；而不同陽性血清與TP17 蛋白的重疊多肽的反應情況存在一定差異，其中10 份臨床陽性血清樣品與Tp17-1、Tp17-2、Tp17-3、Tp17-4 及Tp17-6均可發生特異性反應，且與陰性對照相比差異顯著（P＜0.05）；有9 份臨床陽性血清樣品與Tp17-5均可發生特異性反應，且與陰性對照相比差異顯著（P＜0.05），僅第5 份陽性血清與Tp17-5 多肽反應性較差，與陰性對照相比差異不顯著（P=0.058）。以檢測品OD 值（S）/陰性血清OD 值（N）大于2.1 為判斷標準，所有多肽與臨床陽性血清檢測結果均可判斷為陽性（S/N＞2.1）。見圖7、表3。

圖7 臨床陽性血清樣品與TP17 蛋白及重疊多肽的反應性分析Fig 7 Reactivity analysis of clinical positive serum samples with TP17 protein and overlapping polypeptides

表3 多肽對應的B 細胞表位及陽性血清ELISA 反應結果Tab 3 Peptide corresponding B cell epitope and positive serum ELISA results

3 討論

TP17 是一種附著于梅毒螺旋體外膜內小葉的脂蛋白，約占TP 可溶性蛋白的2%，具有良好的抗原性和免疫原性。B 細胞表位是抗體在抗原表面的識別位點，在臨床診斷和疫苗設計中起著重要作用，關于TP17 蛋白B 細胞表位的研究較少。隨著蛋白質結構和抗原表位研究的發展，生物信息學預測B 細胞表位的準確性也逐步提升。通常情況下，β 轉角為凸出結構，多出現在蛋白質抗原表面，含有5個以上的氨基酸殘基的轉角又常稱為環（loop），而loop 區利于抗體的結合，因此表位多含有環狀結構，而螺旋和折疊結構比較少見，很多蛋白質的C 端具有較好的親水性、表面可及性和柔性，所以是很好的抗原決定簇區域[19]。本研究通過DNASTAR Protean 及SOPMA 預測分析TP17 蛋白的二級結構，分析其α 螺旋、β 折疊、轉角及無規卷曲等二級結構元件的分布情況，結果顯示無規卷曲（42.31%）和β轉角（7.69%）在TP17 蛋白的二級結構中占比較高，結合IEDB 數據庫軟件BepiPred、SOPMA 以及DNASTAR 等對TP17 蛋白進行B 細胞表位分析，采用Hopp-Woods 和Kyte-Doolittle方案、Karplus-Schultz 和Emini 方案、Jameson-Wolf 方案等預測TP17 蛋白親水性、柔韌性、表面可及性、可塑性特征，綜合預測TP17 蛋白的7 個B 細胞線性表位Pro30～Glu38、Leu53～Asp62、Thr64、Thr66～Gln74、Lys82～Tyr91、Ser110～Lys119、Tyr132～Met145。為了增加表位預測的準確性，本研究基于SWISS-MODEL 同源建模構建TP17 蛋白的三維結構，結合IEDB 數據庫預測分析TP17 蛋白的構象表位區域：Lys34～Ala35、Ala55、Pro88、Glu99、Pro136～Pro147、Thr154。結合已解析的TP17 蛋白三維結構數據（4u3q）和同源建模結果，將前述7 個線性B 細胞表位進行定位分析，修正后獲得6 個TP17 蛋白的線性B 細胞表位：Thr27～Glu38、Leu53～Asp62、Thr66～Gln74、Lys75～Pro88、Leu107～Lys119 以及Tyr132～Met145。

為了驗證表位預測的準確性，本研究分段合成了TP17 蛋白多肽（表3），覆蓋蛋白所有氨基酸序列并進行了交叉重疊。選擇10 份梅毒螺旋體抗體及TRUST 雙陽性的臨床血清樣本與TP17 蛋白及Tp17-1～Tp17-6 這6 段多肽進行ELISA 檢測，結果發現，TP17 蛋白與臨床陽性血清樣本具有良好反應性，而不同陽性血清與6 段多肽均能發生特異性反應，但反應情況存在一定差異，與陰性血清均不反應，表明這6 段多肽均含有B 細胞表位，也驗證了本研究預測的抗原表位信息具有較高準確性。本研究分析了TP17 蛋白的B 細胞抗原表位，揭示了TP17 蛋白良好抗原性的分子基礎，為梅毒螺旋體的抗體檢測和疫苗設計提供了理論依據。