基于網絡藥理學及分子對接發掘當歸-川芎藥對治療肺栓塞的作用機制

王坤，王鑫，李琳，張學軍

（1.河南省胸科醫院心內科，鄭州 450003；2.河南省中醫藥大學第三附屬醫院中醫科，鄭州 450003）

肺血栓栓塞癥發病率、致殘率、致死率高[1-2]。抗凝治療是其基礎治療法[3]，但肺栓塞病情多變，部分患者僅單純抗凝治療可出現臨床惡化、遺留慢性血栓栓塞性肺動脈高壓（CTEPH）可能性大、臨床預后差，而增加抗凝藥物劑量可增加臟器出血的風險。中醫藥中當歸補血活血，川芎活血行氣，二者均為活血藥物[4-5]，多用于臨床治療血栓性疾病。但其治療肺栓塞的機制尚需進一步探索，故本研究利用網絡藥理學探索當歸-川芎藥對與肺栓塞的相關性，預測作用靶點，分析作用機制，并利用分子對接技術驗證核心成分與重要靶點間的結合性，以期為當歸-川芎藥對治療肺栓塞提供理論依據，并為后續治療肺栓塞中成藥的研究與開發拓寬思路。

1 材料與方法

1.1 檢索藥物成分 將當歸、川芎通過TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）網站在線檢索其有效藥物成分，納入條件同時滿足OB≥30%和DL ≥0.18。將TCMSP 所得藥物成分導入PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下載藥物成分2D 結構。

1.2 獲取藥物成分靶點 將藥物成分2D 結構（PubChem 下載）導入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）網站，得出藥物成分作用靶點。

1.3 檢索疾病靶點 以“pulmonary embolism”為檢索詞在GeneCards（https：//www.genecards.org/）網站檢索疾病靶點。

1.4 藥物-疾病靶點交集 在線分別導入藥物成分靶點和疾病靶點至venny2.1 網站，得到藥物和疾病交集靶點，即當歸-川芎藥對治療肺栓塞的作用靶點。

1.5 靶點間互作網絡的分析與構建 在線將交集靶點導入STRING（https：//string-db.org/）網站，進行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，設置條件為combined score＞0.4，刪除游離靶點，并將數據通過Cytoscape3.7.2 軟件處理分析，制作PPI 網絡圖。

1.6 富集分析 在線將交集靶點錄入Metascape（http：//metascape.org/）網站，分別進行GO 生物過程（BP）、GO 分子功能（MF）、GO 細胞成分（CC）富集分析，以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路分析，保留P＜0.01 的數據。

1.7 “藥物-靶點-通路”網絡 依據藥物和疾病靶點及KEGG 分析結果，制作network 及type，將network 及type 導入Cytoscape 軟件，分析處理后得到“藥物-靶點-通路”網絡圖，展示藥物、靶點、通路網絡關系，通過Analyze network 分析網絡數據，得出核心成分及靶點。

1.8 分子對接 選取核心成分與其作用的重要靶點進行分子對接。在PubChem 獲取對接化合物的3D 結構，在PDB 獲取對接靶蛋白及配體的晶體結構，利用AutoDock Tools1.5.6 及AutoDock Vina1.1.2 軟件進行分子對接。

1.9 動物實驗驗證

1.9.1 實驗動物和試劑 清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠20 只，體重350～450 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，酶聯免疫吸附試驗試劑盒（南京建成生物工程公司），當歸-川芎藥物（天津中醫藥大學第一附屬醫院提供），聚苯乙烯微球（濟南化道新材料科技有限公司），其余實驗試劑、耗材均有天津醫科大學腫瘤醫院實驗室提供。所有實驗均按照動物倫理規范進行。

1.9.2 實驗方法 將20 只SD 大鼠采用聚苯乙烯微球（2.0×106/100 g）右側頸靜脈注射方法，建立肺栓塞大鼠模型，隨機將模型大鼠分為兩組，即對照組和治療組，每組大鼠各10 只。治療組予以50 mg/（kg·d）當歸-川芎治療，對照組予以等劑量水灌胃，治療14 d 后，采取大鼠血清，酶聯免疫法檢測血清雌激素受體1（estrogen receptor alpha，ESR1）、肉瘤病毒17 癌基因（JUN）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）蛋白表達。

1.10 統計學處理 采用SPSS 26.0 處理分析。符合正態分布的計量資料采用表示，兩組間比較采用t 檢驗。檢驗水平α=0.05，P＜0.01 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物成分 當歸-川芎通過TCMSP 網站在線檢索共獲得藥物成分9 個，其中當歸2 個，川芎7個。將藥物成分導入Swiss Target Prediction 預測靶點后篩出8 個藥物有效成分。

2.2 藥物靶點、疾病靶點及交集靶點 檢索后得到84 個藥物成分靶點，刪除重復靶點，最終得到50 個藥物靶點。疾病靶點刪除重復靶點最終獲得1 172 個靶點。Venny2.1 交集藥物和疾病靶點，最終篩出25個共同靶點，即當歸-川芎藥對通過作用25 個靶蛋白治療肺栓塞（圖1）。

圖1 交集靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of intersection targets

2.3 PPI 網絡交集靶點 通過STRING 網站和Cytoscape 軟件處理并構建PPI 網絡圖，網絡圖包含25 個節點和83 條邊（圖2）。網絡圖顯示靶點間緊密聯系，是當歸-川芎治療肺栓塞的關鍵靶點。

圖2 PPI 網絡圖Fig 2 Protein-protein interaction network diagram

2.4 GO 富集分析 富集分析顯示GO BP 331 個，GO CC 13 個，GO MF 40 個。由Log q 值由小到大排列，并分別將BP、CC、MF 前10 富集制作條形圖（圖3）。

圖3 GO 分析柱狀圖Fig 3 GO enrichment histogram

2.5 KEGG 富集分析 將交集靶點進行KEGG 信號通路分析，共最終獲得88 條信號通路，依據Log q 值由小到大排列，并將最相關前10 條通路制作富集氣泡圖（圖4）。

圖4 KEGG 氣泡圖Fig 4 KEGG bubble diagram

2.6 網絡圖構建 構建藥物-靶點-通路網絡圖（圖5）。結果顯示，8 個當歸-川芎藥對的有效成分通過調控不同通路調節25 個疾病靶點治療肺栓塞。當歸-川芎藥對治療肺栓塞的核心成分為β-谷甾醇、豆甾烯醇、楊梅酮、芎萘呋內酯等。當歸-川芎藥對治療肺栓塞的核心靶點為CASP3、ESR1、JUN、PTGS2 等（表1）。

表1 核心成分對照表Tab 1 Comparison table of core components

圖5 藥物-靶點-通路網絡圖Fig 5 Drug-target-pathway network diagram

2.7 分子對接 將Degree 值排名前4 的核心成分與相作用的重要靶點進行分子對接，分子間的結合能越小，表示其對接性越好，一般結合能≤-5.0 kcal/mol表示具有較好的結合性，最終得出3 種核心分子對接3 個靶點結合性較好（表2，圖6），其中Myricanone與PTGS2 結合性最好。JUN-stigmasterol 在氨基酸殘基GLN-304 處形成氫鍵相互作用；ESR1-beta-sitosterol 在氨基酸殘基SER-518 處形成氫鍵相互作用；Myricanone-PTGS2 在氨基酸殘基PHE-580 處形成氫鍵相互作用；Stigmasterol-PTGS2 在氨基酸殘基MET-261 處形成氫鍵相互作用。

圖6 分子對接示意圖Fig 6 Schematic diagram of molecular docking

表2 核心成分與重要靶點分子對接結果表Tab 2 Docking results of core components and target molecules

2.8 兩組大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表達 依據分子對接結果選出結合性較好的靶蛋白ESR1、JUN、PTGS2。酶聯免疫檢測當-川芎藥對治療肺栓塞大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表達。與對照組相比，治療組大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表達均增加（均P＜0.01），見表3。

表3 兩組大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表達（，ng/mL）Tab 3 Protein expressions of ESR1，JUN and PTGS2 in serum of rats in the two groups（，ng/mL）

表3 兩組大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表達（，ng/mL）Tab 3 Protein expressions of ESR1，JUN and PTGS2 in serum of rats in the two groups（，ng/mL）

注：ESR1：雌激素受體1；JUN：肉瘤病毒17 癌基因；PTGS2：前列腺素內過氧化物合酶2

3 討論

當歸是一味祖國醫學較為常用的活血、補血藥，有效成分主要包含植物甾醇類、苯酞類、黃酮類、生物堿類等，主要通過抗血小板聚集、抗氧化、抗炎鎮痛等生物學過程發揮治療作用[4]。川芎是另外一味祖國醫學常用活血藥物，臨床功效為活血行氣、止痛祛風，多以揮發油類、黃酮類、甾醇類、生物堿類等成分[5-6]，發揮抗凝血、抗動脈粥樣硬化、細胞保護、抗炎、抗氧化等治療作用。在臨床中當歸-川芎藥對聯合應用也較為常見，當歸甘辛溫，入心、肝、脾經，川芎辛溫，入肝、膽、心包經，二者均能活血化瘀，均為血中之氣藥，二藥配伍同用，可增強養血和血、活血祛瘀之功。二者潤燥相互牽制，化瘀時不消耗氣血，養血又不會導致氣滯血壅[7]。總之，當歸-川芎藥對發揮藥理作用和臨床功效是以揮發油類、黃酮類、植物甾醇類等有效成分為基礎的，能夠影響組織缺血的急性損傷，包括抗凝血、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化等過程，同時可以調節血管再生，對于血栓形成及缺血損傷恢復作用有較好的治療效果。

肺栓塞依據中醫證候不同，在中醫上多歸屬于“胸痛”、“厥證”、“胸痹”、“喘證”等范疇[8-9]。中醫學認為肺栓塞主要以氣滯痰瘀互阻、血瘀氣虛、氣閉陽脫等病機為主，主要病位在肺、心、腎。歷代醫者對肺栓塞病因病機的認識有所差異，但是血瘀氣滯、痰瘀互阻被多數學者接受，因此治療多以活血化痰為總治則，并兼以辨證施治。劉建博[10]研究西藥溶栓、抗凝聯合中藥活血化瘀治療肺栓塞，中藥以血府逐瘀湯為基方，依據患者辯證情況，加減施治，療效較好，較單純溶栓抗凝，能夠降低肺栓塞引起的死亡率。杜玲等[11]研究中西醫結合治療下肢靜脈血栓致肺栓塞療效分析，以溶栓和中藥活血化瘀、化痰為主要治療手段，發現在治愈率和死亡率上，中西醫結合治療均優于溶栓治療。王峰等[12]用丹蛭通脈方聯合抗凝治療肺栓塞，可以改善患者右心功能以及中醫證候，并且減少出血風險。韓麗等[13]研究抗凝溶栓聯合自擬逐瘀養肺方治療肺栓塞，發現中醫藥聯合治療能夠更好地改善血液黏滯性與流動性，促進阻塞血管復通，恢復血氧供應，降低肺動脈壓，改善肺栓塞患者預后。當歸和川芎是補血、活血藥物，臨床多用于治療血瘀性疾病，這與肺栓塞的核心病因病機相契合。并且多數治療肺栓塞中醫藥組方中均使用當歸和川芎。

本研究篩選核心藥物成分4 個，其中當歸2 個核心成分，分別為β-谷甾醇、豆甾烯醇，川芎2 個核心成分，分別為楊梅酮、芎萘呋內酯。β-谷甾醇、豆甾烯醇二者為植物甾醇類物質。β-谷甾醇一種植物類固醇，是動植物細胞膜重要的組成之一，具有降膽固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌和類激素功能等多種生物活性[14]。研究顯示β-谷甾醇能夠調節脂代謝途徑，從而保護組織缺血再關注損傷[15]。豆甾醇可以清除氧自由基，具有明顯的抗氧化作用，能夠減少缺血損傷后的氧化應激[16]。楊梅酮是黃酮類化合物，具有抗血小板聚集、抗凝、抗炎、降血糖及保護神經等藥理作用[17]。方晴霞等[18]研究顯示，楊梅酮能夠降低血小板聚集，減少血栓形成。Chen 等[19]研究顯示，楊梅黃酮能夠明顯抑制過氧亞硝酸鹽誘導的DNA 斷裂，減少羥基自由基形成，進而降低神經病變。夏淑芳等[20]研究顯示，楊梅黃酮能夠調節脂代謝，預防脂肪肝。缺氧誘導因子（HIF）-1 信號通路在機體對低氧濃度的應答中至關重要，是缺氧狀態下的主要調節因子。最近的研究表明，HIF 信號通路不僅可以通過降低氧氣利用率來誘導一系列的適應性反應，而且在細胞損傷后發揮保護作用[21]。

綜上所述，當歸-川芎藥對可以用于治療肺栓塞，主要通過調節HIF-1、脂代謝、神經變性等信號通路的ESR1、JUN、PTGS2 等疾病靶點，干預酶的活性、抗血小板聚集、抗凝等生物學過程，進而治療肺栓塞。