營養瓊脂培養與R2A培養檢測口腔診療用水比較研究

洪飛若 俞雪芬 金慧 陸燁 普睿 錢清

口腔綜合治療椅水路系統(dental unit waterlines，DUWLs)因治療回吸等原因導致管道內壁細菌生物膜形成而污染診療用水[1]，使得口腔診療存在院內感染的風險[2-3]。各級各類口腔醫療機構應定期對診療用水進行微生物檢測，并實施有效的處理措施[4-6]。我國對口腔醫療機構診療用水的檢測方法與標準要求均參照生活飲用水[7-8]，其微生物檢測方法采用的是營養瓊脂(nutrient agar，NA)培養基，37 ℃、48 h培養后計菌落數，合格標準為≤100(CFU/mL)。而歐美等國家采用的是R2A(Reasoner's 2 agar)培養基[9]，經20～25 ℃培養120～168 h后計菌落數，合格標準為≤500 CFU/mL[10]。本研究通過采用兩種培養基平行培養口腔診療用水水樣的方法，比較分析兩者之間的培養結果，為口腔診療用水微生物培養探索合適的方法。

1 資料與方法

1.1 實驗設備與材料

營養瓊脂培養基(廣東環凱)；R2A培養基(北京陸橋)；一次性培養皿、渦旋振蕩儀、生理鹽水、離心管、接種環、移液器、恒溫培養箱、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS，VITEK?MS, 法國)。

1.2 樣本來源與采樣方法

選取浙江大學醫學院附屬口腔醫院8 個科室24 臺牙椅，采樣時間段為上午8：30～9：00，采樣點選擇每臺牙椅的牙科手機連接管、三用槍和漱口處。放水沖洗管路30 s后各樣本均取10 mL，每個出水端分別采集3 個樣本，共采集水樣216 份。同一部位的水樣編寫同一個序號，隨機分為3 組，分別送至3 個實驗室進行平行培養檢測。所有水樣采集后立即儲存于4 ℃轉運箱，4 h內完成平板接種。

1.3 菌落培養和計數

每份水樣采用傾注法分別于NA和R2A培養基各接種1 mL。NA培養基稀釋一個梯度接種，37 ℃下培養48 h后進行菌落計數。因R2A培養基培養菌落數可能較NA培養基多，為得到可分辨的計數結果，因此分別稀釋1 個梯度和2 個梯度接種于R2A培養基，25 ℃下培養120 h。2 種方法均進行一份平行接種，并且設置空白對照。結果判斷標準均參照國家生活飲用水衛生標準[7]，即菌落計數≤100 CFU/mL為合格。

1.4 菌種檢測

隨機抽取96 份菌落計數結果不合格的培養皿，兩種培養方法各48 份。使用一次性接種環選取同一培養皿上形態各異的單個菌落涂布于質譜儀靶板上，每個細菌靶點添加1 μL VITKE MS-CHCA基質液。待干后采用質譜儀對不同培養基中的菌種進行鑒定，質控菌株為大腸桿菌(ATCC-8739)。將所測得樣本細菌的質譜圖與數據庫中所有參考圖譜進行比對得到最終結果。

1.5 統計學分析

數據雙盲錄入后應用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，定量資料采用四分位數描述，菌落計數結果差異采用Wilcoxon符號秩檢驗進行分析，不同培養方法檢測樣本合格數量和機會性致病菌檢出率的比較采用配對卡方檢驗及Kappa一致性檢驗進行分析。三處采集點菌落計數的差異采用Kruskal-WallisH檢驗進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。由于菌落計數呈非正態分布，因此對兩組菌落計數(CFU/mL)取對數，計算所得Log10(菌落計數)，采用Bland-Altman圖分析評價兩種培養方法的一致性。

2 結 果

2.1 2 種培養基菌落計數結果分析

本研究采集216 份口腔診療用水樣本，使用NA培養基和R2A培養基，在37 ℃和25 ℃條件下培養48和120 h，共檢測樣本432 份。培養結束后進行菌落計數，并計算同一平行樣本的平均值為最終實驗結果。

由表1可知，同一水樣由R2A培養基檢出的結果中位數較NA培養基顯著增加，兩者比值為20.56。Wilcoxon符號秩檢驗分析結果顯示兩組結果的差異具有統計學意義(P<0.001)，分別對不同部位的菌落計數進行對比，均顯示兩種培養方法結果的差異有統計學意義(P<0.001)。

表1 口腔綜合治療臺不同部位和不同培養基培養菌落計數的對比

配對卡方檢驗結果顯示，采用McNemar精確檢驗發現兩組培養結果合格率的差異有統計學意義(P<0.001)，Kappa值=0.207，屬于一致性較差(表2)。

表2 兩種培養方法檢出結果的合格情況

2.2 檢出菌種構成比較

NA培養基共檢出6 科、26 株機會性致病菌，R2A培養基共檢出5 科、53 株機會性致病菌，檢出率分別為47.92%(23/48)和66.67%(32/48)，兩者之間差異不具有統計學意義(P=0.211)，Kappa值=-0.685，屬于一致性較差，檢出菌株均為革蘭氏陰性菌(表3)。

表3 口腔診療用水檢出菌種構成的比較

2.3 Bland-Altman分析進行一致性比較

以檢出菌落計數對數值的均值為橫坐標，檢出菌落計數對數值的差值為縱坐標，菌落計數的對數值差值在坐標系中以點的形式表示，做直線Y=D±1.96*SD劃定一致性上限和下限，繪制Bland-Altman分析圖(圖1)。其中藍色虛線為95%一致性界限，紅色實線為菌落計數對數值差值的均數，黑色實線為0刻度線。

圖1 Bland-Altman 圖比較不同培養方法的一致性

結果顯示，2.78%(6/216)的點分布在一致性界限之外，菌落計數對數值差值的均數為1.14(轉換為菌落計數=13.80 CFU/mL)，一致性上限為2.898(790.68 CFU/mL)，下限為-0.617(0.24 CFU/mL)，差值上下限范圍為790.44 CFU/mL，為臨床無法接受的差值范圍。98.15%(212/216)的點在0刻度線以上，表示98.15%的R2A培養菌落計數結果較NA培養結果高。綜上所述，兩者一致性較差，不能相互代替使用。

2.4 不同采樣部位菌落計數比較

Kruskal-Wallis H檢驗結果顯示：3 個部位的水樣通過NA培養所得的菌落計數差異無統計學意義(H=1.829，P=0.401)，但R2A培養所得3 個部位的水樣菌落計數的差異有統計學意義(H=8.394，P=0.015)。然而，進一步兩兩比較后發現，僅三用槍出水與漱口水的結果差異有統計學意義(校正后P=0.026)，手機連接管出水與三用槍出水的校正后P值為1.000，漱口水與手機連接管出水校正后的P值為0.052。

3 討 論

口腔綜合治療椅水路系統的微生物污染問題已成為口腔醫護人員的共識，未經處理的水存在大量的致病菌[11-13]，如嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、非結核分枝桿菌等。污染的診療用水通過牙科手機、三用槍等形成氣溶膠，將醫護人員及患者置于被感染的風險中。有研究者從牙科手術過程中產生的水和氣溶膠中檢測到高水平的細菌內毒素[14]。因此，定期檢測并有效降低DUWLs中的細菌水平有重要意義。

細菌培養是監測醫療用水水質、評估微生物污染程度的基本方法。目前我國口腔診療機構基本采用富營養培養基進行細菌檢測，即營養瓊脂37 ℃、48 h培養；而歐美等則采用貧營養的R2A培養基20～28 ℃、5～7 d培養[9]。對于水生細菌而言，最理想的生長條件是營養成分相對較貧乏的培養基和與室溫接近的環境溫度[15]；富營養培養基則會抑制水體中生長緩慢或處于受損狀態的細菌生長，導致菌落計數偏低而影響感控管理的決策。除此之外，由于DUWLs多使用含氯消毒劑進行定期消毒，而R2A培養基中的丙酮酸鈉成分能將受到含氯消毒劑損傷的存活細菌復蘇，并在適宜條件下生長形成菌落[16]。因此，相較富營養培養基，R2A培養基能夠提高水生細菌檢測的靈敏度，尤其是經含氯消毒液處理后的水體。本研究細菌培養結果證實，同一水樣分別用R2A培養基和NA培養基進行培養，前者檢出的菌落數明顯高于后者，且兩者一致性較差。目前國內尚未有相關規范要求使用R2A培養基檢測口腔診療用水，但已有研究證明了R2A培養基對血液透析用水和制藥用水微生物污染水平檢測的有效性[17-18]。本研究結果也進一步說明R2A培養基對醫療用水微生物檢測的必要性。

菌種鑒定結果發現(表3)，R2A培養基對機會性致病菌的檢出率高于NA培養基，但兩者間的差異不具有統計學意義，可能原因為檢測樣本的數量較小，后續研究可加大樣本量的致病菌檢測。R2A培養基中檢出率最高的藤澤甲基桿菌在NA培養中未被檢出。甲基桿菌屬適宜在水中生長，易黏附于管道表面形成生物膜[19]，是引起醫療機構相關性感染的條件病原體之一。有報道稱多例骨髓移植術后患者因使用甲基桿菌屬污染的自來水漱口導致嗜中性支原體引起的血液感染發生[20]。貪銅菌和少動鞘氨醇單胞菌在R2A培養樣本的檢出率同樣高于NA培養。貪銅菌是一種非發酵革蘭陰性桿菌，易引起免疫功能低下的人群感染。國外曾報道1 例由少見貪銅菌引起的幼兒肺炎[21]，我國學者也曾報道一例由耐金屬貪銅菌感染引起的嬰兒脾臟多發膿腫[22]。另外，鞘氨醇單胞菌屬被證明能夠在各種輸水管道(例如DUWLs)內壁形成生物膜，而少動鞘氨醇單胞菌則被認為是該菌屬的主要條件致病菌，能引起液體相關的感染[23]。Santarelli等[24]曾報道1 例由少動鞘氨醇單胞菌感染導致的口腔潰瘍，進而引起發熱，這提示該細菌有可能通過口腔途徑傳播引起全身性感染的風險。雖然本研究未檢測出非結核分枝桿菌，但有文獻報道3 例因感染牙椅水路定植的非結核分枝桿菌而引起的牙源性面部竇道[25]，同樣說明單一的NA培養不能滿足口腔診療用水微生物的檢測。本研究結果表明目前我國口腔診療用水的NA培養方式不利于條件致病菌的檢出，因此，有必要將R2A培養作為口腔診療用水微生物檢測的常規培養方式，以期更準確地評估口腔診療用水的細菌污染情況和制定相應的干預措施。另外，R2A培養基的培養結果明顯高于NA培養基，美國CDC制定的≤500 CFU/mL的合格標準可能更符合臨床實際情況，但由于水生細菌在不同地域分布情況有所不同，因此采用R2A培養基的情況下應探討制定更符合臨床實際的菌落總數限值。

本研究發現接受定期消毒措施的DUWLs仍存在一定程度的微生物污染情況(表1)。比較不同部位水樣的菌落計數時發現通過NA培養基培養的菌落計數差異無統計學意義，這與以往報道結果相似[26]。但在對通過R2A培養基培養的菌落計數進行比較時，發現三個部位的菌落計數差異有統計學意義，可能原因為NA培養基培養所得結果普遍低估水樣中真實細菌總數，各數值之間的差距不足以造成顯著性差異。通過事后兩兩比較發現僅三用槍出水與漱口水之間差異有統計學意義，分析認為可能與漱口水不存在回吸但存在水生微生物污染有關。另外，為了減少實驗影響因素，本研究在進行兩種培養方法時統一采取較簡便的傾注法接種樣本。有研究表明[27]，不同的接種方法、溫度和培養時間均會對水樣中細菌培養結果產生一定的影響。因此，下一步研究可以探討R2A培養條件下，不同接種方式(包括傾注法、涂布法和薄膜過濾法)，不同溫度(20～28℃)和不同培養時長(5～7 d)對口腔診療用水中細菌檢出結果的影響。

綜上所述，DUWLs污染問題普遍存在，并且有感染的風險。對微生物污染的控制重點在于定期的檢測與有效的消毒，而選擇合適的檢測方式具有較大的臨床實踐意義。建議口腔診療機構在定期檢測診療用水時應常規采用貧營養的R2A培養基，提高水生細菌的檢出率，且制定限值規范時應參考不同地域臨床實際情況。由于本研究用于菌株鑒定的水樣均采集于經低濃度含氯消毒液處理后的DUWLs，而甲基桿菌和鞘氨醇單胞菌均為耐氯菌株，其高檢出率也提示消毒DUWLs時應考慮細菌對消毒劑的耐受性。