熊果酸通過miR-224/NLRP3軸抑制牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激的RAW264.7細胞M1極化

陳海龍 宗靜 宋曉彤

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)是引發牙周炎的主要病原菌，其細胞壁主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通過促使巨噬細胞M1極化來分泌炎性因子，誘導免疫炎癥反應，從而造成牙周組織損傷[1-4]。目前消除病原體和重建正常口腔菌群是針對牙周炎治療的重點，隨著治療過程中抗生素類藥物的過度使用及其耐藥性的產生，迫切需要尋找抗生素替代藥物用以治療牙周炎[5]。熊果酸已被證明是一種具有抗Pg作用的抗菌化合物，可通過影響細菌膜電位來增加膜通透性，促使膜破裂，以此具有殺菌活性，但是在牙周炎中，熊果酸對巨噬細胞M1極化的影響機制還未闡明[6]。NLRP3作為一種模式識別受體，在宿主防御病原體過程中具有關鍵作用，研究發現Pg-LPS激活的RAW264.7巨噬細胞中NLRP3表達顯著增加，而降低其表達可抑制炎癥反應[7-8]。NLRP3是miR-224-5p的靶基因，miR-224-5p通過抑制NLRP3表達降低小膠質細胞炎癥激活[9]。因此，本研究對熊果酸是否可通過miR-224/NLRP3軸影響Pg-LPS刺激的RAW264.7細胞M1極化進行了探究，以期為熊果酸在牙周炎中的治療機制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器

小鼠巨噬細胞系RAW264.7(YCL-0190，武漢益普生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(BN17003-0.75 mL，北京百瑞極生物科技有限公司)；BCA蛋白含量檢測試劑盒、RPMI-1640培養基、蛋白提取試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(CDLG-5055、CD-02168-ML、CD-13559-ML、CDLG-4997，武漢純度生物科技有限公司)；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗抗體(A-11001，Invitrogen Antibodies)；兔抗β-actin抗體(ab8227，Abcam，英國)；NLRP3抗體(19771-1-AP，Proteintech);miR-224 mimics、mimic control、pcDNA3.1、miR-224 inhibitor、inhibitor control、pcDNA3.1-NLRP3、實時熒光定量PCR儀(賽默飛世爾，美國)；MTT檢測試劑盒(ZY111105-500，上海澤葉生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素10(IL-10)檢測試劑盒(CSB-E11987r-1、CSB-E04593h，上海恒斐生物科技有限公司)；白介素1β(IL-1β)檢測試劑盒(SEKR-0002，北京索萊寶科技有限公司)；精氨酸酶1(Arginase-1，Arg-1)(EHJ-ZH0063，廈門慧嘉生物科技有限公司)；BioSpectrum-美國UVP凝膠成像系統(上海天放實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 RAW264.7細胞接種到DMEM培養基(含100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素+10%胎牛血清)內，并于常規培養箱(37 ℃、5%CO2)中培養至細胞融合到70%～80%時胰酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測RAW264.7細胞活力 對數生長期RAW264.7細胞濃度調整為1×105個/mL后以100 μL/孔的量接種到96 孔板中，培養24 h后在每孔中分別添加0、5、10、20、40、80 μmol/L熊果酸(每個濃度設5 個復孔)[10]，再培養48 h后吸出舊培養基，并添加MTT(5 μg/L，20 μL)常規培養4 h，加入二甲基亞砜(150 μL)后在酶標儀490 nm處檢測吸光度(A490)值：細胞活力(%)=處理組/對照組×100%。

1.2.3 分組 將RAW264.7細胞分為對照組、LPS組(1 mg/LPg-LPS)[8]、熊果酸組(40 μmol/L熊果酸)、inhibitor control組(40 μmol/L熊果酸+inhibitor control)、miR-224 inhibitor組(40 μmol/L熊果酸+miR-224 inhibitor)、mimics control組、miR-224 mimics組；取對數生長期RAW264.7細胞，并按照Li-pofectamineTM2000說明書步驟將miR-224 inhibitor、inhibitor control、mimics control及miR-224 mimics分別轉至相應組的RAW264.7細胞中，按照分組情況加入40 μmol/L熊果酸及1 mg/LPg-LPS培養48 h。

1.2.4 qRT-PCR檢測miR-224表達水平 根據Trizol法提取各組RAW264.7細胞中總RNA后檢測RNA濃度及純度，根據反轉錄試劑盒步驟將其反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，U6為內參，2-ΔΔCt計算miR-224表達情況(設置5 個重復)，miR-224上游引物5′-CTGGTAGGTAAGTCACTA-3′，下游引物5′-TCAACTGGTGTCGTGGAG-3′；上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-10及Arg-1水平 收集各組RAW264.7細胞培養上清液后，按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，在酶標儀中檢測各組細胞吸光度，計算TNF-α、IL-1β、IL-10及Arg-1水平(設置5 個重復)。

1.2.6 流式細胞術檢測RAW264.7細胞中CD11c+和CD206蛋白表達情況 將各組RAW264.7細胞懸浮液(1×106個/mL)進行離心、棄上清、PBS重懸(200 μL)，添加PE-CD11c+、FITC-CD206染色30 min后PBS洗滌、多聚甲醛固定(4%)、0.1%皂素(100 μL)破膜10 min，PBS洗滌后重懸，轉移至流式管，經流式儀CD11c+和CD206蛋白表達(n=5)。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-224和NLRP3的靶向關系 通過TargetScan網址確定miR-224和NLRP3結合位點，NLRP3 3＇-UTR片段經擴增、酶切和連接后進行野生型pmirGLO-NLRP3-wt表達載體的構建，并且經過將結合片段部分核苷酸突變，獲得突變型pmirGLO-NLRP3-mut表達載體，將miR-224 mimics、mimic control分別與二者進行轉染：pmirGLO-NLRP3-wt+miR-224 mimics組、pmirGLO-NLRP3-wt+mimic control組、pmirGLO-NLRP3-mut+miR-224 mimics組、pmirGLO-NLRP3-mut+mimic control組，培養48 h后吸去培養基后PBS清洗、細胞裂解液(200 μL)裂解細胞，離心后取上清轉至新EP管中，按照雙熒光素酶試劑盒說明書操作進行染色，海腎熒光值為內參，在酶標儀中分別檢測螢火蟲及海腎熒光值，最終計算熒光素酶相對活性。

1.2.8 Western blot檢測RAW264.7細胞中NLRP3表達 細胞裂解液裂解RAW264.7細胞后提取總蛋白，并使用BCA蛋白試劑盒測定蛋白含量；50 μL上樣緩沖液和200 μL蛋白樣品混勻、變性(100 ℃)，以30 mg/孔進行SDS-PAGE凝膠電泳后、轉膜、脫脂奶粉封閉(1 h)，加入兔抗NLRP3、β-actin(1∶1 000)一抗過夜孵育(4 ℃)，PBS清洗后孵育二抗(2 h)，ECL化學發光試劑顯影后于蛋白凝膠成像儀中觀察，Image J分析條帶灰度值，分析NLRP3蛋白水平(n=5)。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 熊果酸對RAW264.7細胞活力的影響

RAW264.7細胞存活率(100±8.32、88.35±8.04、75.22±10.30、62.91±8.34、51.68±7.13、40.54±6.62)%隨熊果酸濃度的增加(0、5、10、20、40和80 μmol/L)而顯著降低(P<0.05)，存在劑量依賴性，選取40 μmol/L濃度熊果酸進行后續實驗。

2.2 熊果酸對RAW264.7細胞極化的影響

3 組間IL-10、Arg-1、CD206水平差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組相比，LPS組TNF-α、IL-1β、CD11c+水平顯著增加(P<0.05)；與LPS組相比，熊果酸組TNF-α、IL-1β、CD11c+水平顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 熊果酸對RAW264.7細胞極化的影響(n=5)

2.3 miR-224靶向調控NLRP3的表達

通過TargetScan網址預測，miR-224與NLRP3存在靶向結合位點(圖1)；與pmirGLO-NLRP3-wt+mimic control組(0.91±0.16)相比，pmirGLO-NLRP3-wt+miR-224 mimics組熒光素酶活性(0.49±0.11)顯著降低(P<0.05)，而兩組MUT熒光素酶活性無顯著性差異(0.88±0.14vs0.87±0.16，P>0.05)；與對照組(1.21±0.20)相比，mimic control組(1.20±0.23)無顯著差異，miR-224 mimics組NLRP3蛋白水平(0.72±0.11)顯著降低(P<0.05)(圖2)。

圖1 miR-224與NLRP3結合位點

圖2 miR-224過表達對NLRP3蛋白表達的影響

2.4 miR-224過表達對RAW264.7細胞極化的影響

3 組間IL-10、Arg-1、CD206表達差異無統計學意義(P>0.05)；與LPS組相比，mimic control組TNF-α、IL-1β、CD11c+水平無顯著性差異(P>0.05)，miR-224 mimics組TNF-α、IL-1β、CD11c+水平顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 miR-224過表達對RAW264.7細胞極化的影響(n=5)

2.5 熊果酸對RAW264.7細胞miR-224及NLRP3表達的影響

與對照組相比，LPS組miR-224表達水平顯著降低，NLRP3表達水平顯著增加(P<0.05)；與LPS組相比，熊果酸組miR-224表達水平顯著增加，NLRP3表達水平顯著降低(P<0.05)(表3, 圖3)。

表3 熊果酸對RAW264.7細胞miR-224及NLRP3表達的影響(n=5)

圖3 熊果酸對NLRP3蛋白表達的影響

2.6 miR-224表達沉默逆轉熊果酸對RAW264.7細胞極化的影響

4 組間IL-10、Arg-1、CD206表達差異無統計學意義(P<0.05)；與LPS組相比，熊果酸組TNF-α、IL-1β、CD11c+表達顯著降低(P<0.05)；與熊果酸組相比，inhibitor control組TNF-α、IL-1β、CD11c+表達無顯著性差異(P>0.05)，miR-224 inhibitor組TNF-α、IL-1β、CD11c+表達顯著增加(P<0.05)(表4)。

表4 miR-224表達沉默逆轉熊果酸對RAW264.7細胞極化的影響(n=5)

3 討 論

牙周炎是一種可造成牙齒脫落的慢性炎癥性疾病，其特征在于進行性牙槽骨破壞和牙周炎癥[11]。牙周炎不僅會導致牙齒脫落，影響患者生活質量，還會增加糖尿病及心血管疾病的發生風險[5]。革蘭氏陰性厭氧桿菌Pg是牙周炎的主要致病菌，可釋放LPS等致病因子誘導牙周大量IL-1β、TNF-α等促炎因子的分泌，造成炎癥損傷[5]。巨噬細胞根據刺激分為兩個主要亞群：M1和M2型，LPS可誘導巨噬細胞M1極化，而M1巨噬細胞是促炎因子的主要來源，該細胞的激活會造成牙周炎進程中促炎狀態的啟動和維持，而M2巨噬細胞可產生IL-10、Arg-1等抗炎因子，促進組織修復[5,12]，因此消除病原體，抑制巨噬細胞M1極化，從而抑制其產生的炎癥損傷是牙周炎治療的關鍵[5,13]。但由于牙周炎的復發性，造成患者大量使用抗生素類藥物，最終產生耐藥性，因此尋找有效抗生素替代藥物對疾病的治療極其重要[5]。

熊果酸是一種可從女貞等中草藥植物中的抗菌化合物，研究發現，其對牙周病原菌具有有效殺菌作用[14]。蜂膠是一種用于治療牙周病的傳統民間藥物，其有效成分熊果酸可通過使Pg膜破裂，而具備殺菌活性[6]。從番石榴葉中所分離的熊果酸能夠抑制LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞產生的活性氧及炎癥介質，起到抗炎作用[15]。CD11c+是M1型巨噬細胞的特異性標志物，而CD206是M2型巨噬細胞標志物[16-17]。本研究發現，Pg-LPS顯著增加RAW 264.7巨噬細胞中TNF-α、IL-1β、CD11c+蛋白表達，而熊果酸則可顯著降低Pg-LPS誘導的TNF-α、IL-1β、CD11c+蛋白水平，而對IL-10、Arg-1、CD206蛋白水平無顯著影響。該結果表明，熊果酸能夠抑制Pg-LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞M1極化，這可能是熊果酸在牙周炎中的抗炎機制之一。

微小RNA(miRNA)可通過與目標mRNA的互補序列結合來抑制mRNA翻譯或致使轉錄物降解，以此參與牙周炎等炎癥性疾病的發生[4]。miR-224高表達可通過下調Ras相關的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)水平來保護牙髓干細胞免受凋亡，從而促進修復缺陷組織[18]。研究發現，miR-224的靶基因NLRP3參與牙周炎的發生，其在牙周炎患者牙齦組織中表達異常增加，并且與IL-1β表達水平正相關[9,19]。NLRP3作為胞內模式識別受體可在識別微生物入侵時被顯著激活，有研究發現Pg可誘導RAW 264.7巨噬細胞中NLRP3炎性體激活，而去除Pg則可恢復NLRP3的表達[8,19]。經受力刺激的牙周膜細胞通過激活巨噬細胞中的NLRP3表達來促進M1巨噬細胞極化及IL-1β產生[20]。本研究發現，Pg-LPS顯著降低miR-224表達，增加NLRP3蛋白表達，并且發現NLRP3是miR-224的潛在靶基因，這與前人研究結果相似，還發現，miR-224過表達可降低TNF-α、IL-1β、CD11c+蛋白水平，而對IL-10、Arg-1、CD206蛋白水平無顯著影響，上述結果表明，miR-224/NLRP3參與Pg-LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞M1極化，促進miR-224表達可抑制RAW 264.7巨噬細胞M1極化，從而抑制炎癥反應。本研究還發現熊果酸可增加miR-224表達水平，而降低NLRP3表達，而miR-224表達沉默可逆轉熊果酸對TNF-α、IL-1β、CD11c+表達的影響。該結果表明熊果酸對RAW 264.7巨噬細胞M1極化的抑制作用可能與miR-224/NLRP3有關。

綜上所述，熊果酸可通過促進miR-224/NLRP3軸來抑制Pg-LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞M1極化。本研究不僅為牙周炎新的有效治療藥物的尋找提供有價值的參考，還為熊果酸在牙周炎中的抗炎機制研究提供依據，但本研究未對miR-224/NLRP3下游機制進行深入探究，這將成為本研究下階段的研究內容。