淫羊藿苷與鹽酸米諾環素聯合應用的抗菌及促成骨性能研究

劉寧 林媛 韓林藝 胡思雨 王一欽 何虹潔

種植體周圍炎是導致種植體修復失敗的主要原因之一。目前，普遍認為種植體周圍炎是由菌斑聚集引發的感染性疾病，炎癥突破軟組織封閉導致種植體周圍骨組織吸收，患病率約為14%～30%[1]。因此，種植體周圍炎的治療應注重緩解炎癥的同時促進骨再生。淫羊藿苷(icariin，ICA)是從中藥淫羊藿中提取的一種黃酮類化合物，是淫羊藿的主要活性成分之一。已有研究表明，淫羊藿苷對促進骨再生、抑制骨吸收、減輕炎癥反應、調節免疫反應等方面具有明顯作用[2-3]。鹽酸米諾環素(minocycline hydrochloride，MH)是目前臨床上種植體周圍炎局部治療的常用抗生素藥物[4]。已有研究證實，中藥與抗生素聯合應用可提高抗生素的治療效果，減少不良反應，甚至可以逆轉細菌對一些抗生素的耐藥性[5]。ICA與MH聯合應用對種植體周圍炎致病菌及骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作用的研究尚未見報道。本研究旨在探究ICA與MH聯合應用對種植體周圍炎致病菌的抑菌作用及對BMSCs成骨分化的影響，為種植體周圍炎的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淫羊藿苷(散劑，MedChemExpress，德國)；鹽酸米諾環素(膠囊劑，浙江杭州瀚暉制藥有限公司)；腦心浸液培養基(BD，美國)；α-MEM培養基、胎牛血清、PBS緩沖液(Hyclone，美國)；Cell Counting Kit-8(CCK-8，Dojindo Laboratories，日本)；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(上海碧云天)；茜素紅(蘇州賽業)；Trizol、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master、LightCycler qPCR分析儀、熒光定量PCR分析儀(Roche，瑞士)；酶標儀(BioTek，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養 取凍存的牙齦卟啉單胞菌(Pg，ATCC33277)和具核梭桿菌(Fn，ATCC10953)菌株涂于含有 10%無菌脫纖維羊血的BHI培養板中(加氯化血紅素和維生素K)，置于37 ℃厭氧箱內培養。復蘇成功后挑取單菌落涂布于新的腦心浸液培養基(brain heart infusion,BHI)瓊脂培養板上。待平板上形成形態均一的菌落后，挑取單克隆菌落接種至 BHI液體培養基中進行增菌培養。麥氏比濁法比濁，用BHI液體培養基將菌液稀釋配制成濃度1.0×107CFU/mL 的菌懸液備用。

1.2.2 ICA與MH體外聯合用藥實驗 采用微量方陣棋盤法設計，在96 孔板橫縱兩個方向上交差加入ICA和MH，ICA的終濃度為1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L，MH的終濃度為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 μg/mL，菌懸液終濃度為 1×106CFU/mL，并設置菌液對照組和藥液對照組，輕輕震蕩后，置于37 ℃厭氧箱內培養48 h后，酶標儀于波長600 nm測定每孔樣本A值。計算抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index，FICI)，FICI=ICA聯合時MIC/ICA單用時MIC+MH聯合時MIC/MH單用時MIC，FICI≤0.50 為協同作用，0.502.00為拮抗作用[6]。

1.2.3 細胞培養 SD大鼠BMSCs為本實驗室凍存。使用含有1%青霉素、鏈霉素，10%胎牛血清的α-MEM培養液在37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每3 d更換培養液，待細胞達到70%～80%匯合時，進行傳代培養。

1.2.4 CCK-8實驗 96 孔板每孔接種3×103個BMSCs細胞，置于培養箱中培養24 h后，更換培養液。分別加入含有不同濃度ICA(1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)和MH(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μg/mL)的α-MEM培養液，并設立不加藥物的培養液對照組和無細胞的空白組，每組設置3 個復孔。在藥物加入后的0、1、3、5、7 d更換孔內培養基為含10% CCK-8的無血清α-MEM培養液，繼續培養3 h后，酶標儀于波長450 nm測定樣本A值。

1.2.5 ALP活性檢測 24 孔板每孔接種0.5×104個BMSCs細胞，置于培養箱中培養24 h后，更換培養液，藥液分組同1.2.4。第3天換1 次培養液，培養7 d后，PBS漂洗，加入0.1% Triton X-100，37 ℃條件下裂解30 min，離心后按照ALP活性檢測和BCA蛋白定量試劑盒操作說明進行操作，計算各組ALP活性及蛋白含量。

1.2.6 RT-PCR分析 6孔板每孔接種1×105個BMSCs細胞，置于培養箱中培養24 h后，更換培養液。分別加入含1×10-7mol/L ICA、1×10-8mol/L ICA、1 μg/mL MH、1×10-7mol/L ICA+1 μg/mL MH、1×10-8mol/L ICA+1 μg/mL MH的α-MEM培養液，并設立不加藥物的培養液對照組，每組設置3 個復孔。第3天換1 次培養液，培養7 d后，PBS漂洗，使用TRIzol提取細胞總RNA，按照cDNA 反轉錄試劑盒的反轉錄體系進行反轉錄。配制SYBR Green qPCR反應體系后，于LightCycler qPCR儀器中進行檢測，以GAPDH為內參，對成骨相關基因Runx2、ALP、OCN、Col-1進行RT-PCR 分析。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列表

1.2.7 茜素紅染色及鈣含量半定量分析 24 孔板每孔接種0.5×104個BMSCs細胞，置于培養箱中培養24 h后，更換含成骨誘導液的培養液，藥液分組與1.2.6 RT-PCR分析實驗相同。每3 d換1 次培養液，培養21 d后，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗，加入茜素紅染液染色30 min，再次用PBS漂洗，在顯微鏡下觀察拍照。拍照完成后，每孔加入10% 氯化十六烷基吡啶0.5 mL，待鈣結節溶解后，移液至96 孔板中，酶標儀于波長570 nm測定樣本A值，以對照組為基準，對礦化程度進行半定量分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗后，使用單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩比較采用LSD法檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 ICA聯合MH的微量方陣棋盤實驗

檢測濃度范圍內單藥ICA對P.gingivalis的MIC為1×10-4mol/L,對F.nucleatum無抑菌作用。ICA和MH聯合應用能有效降低MH的MIC濃度，聯合應用對P.gingivalis表現出協同作用，對F.nucleatum表現出相加作用(表2)。

表2 微量方陣棋盤實驗結果

2.2 ICA和MH對BMSCs增殖的影響

第1、3、5、7天，相比于完全培養液對照組，檢測濃度范圍內的ICA和MH均具有促進BMSCs增殖的作用(P<0.05)。在第7天，1×10-8mol/L ICA對BMSCs促增值的作用最強，除1×10-9mol/L ICA外，與其它濃度ICA相比差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1A)。在第7天，1 μg/mL MH對BMSCs促增值的作用最強(P<0.05)(圖1B)。

圖1 ICA和MH對BMSCs增殖的影響

2.3 ICA和MH對ALP活性的影響

培養7 d后，1×10-7mol/L ICA顯著增強BMSCs的ALP活性(P<0.05)(圖2A)。0.062 5、0.125、0.25和1 μg/mL MH均具有增強ALP活性的作用(P<0.05)(圖2B)。

圖2 ICA和MH對BMSCs中ALP活性的影響

2.4 成骨分化相關mRNA檢測

培養7 d后，ICA和MH聯合應用組的Runx2和OCN mRNA表達水平顯著高于其它各組(P<0.05)。與1 μg/mL MH單獨應用組相比，聯合應用組的ALP表達與其差異有統計學意義，1×10-7mol/L ICA+1 μg/mL MH組的Col-1表達與其差異有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 ICA和MH聯合應用對BMSCs中成骨分化相關mRNA表達水平的影響

2.5 茜素紅染色及鈣含量半定量分析

成骨誘導培養21 d，各組細胞茜素紅染色鏡下均觀察到紅色礦化結節，外圍呈橘紅色，中心呈紅棕色。ICA和MH聯合應用組的礦化結節相對較大，數量較多(圖4)。鈣含量半定量分析結果顯示，1×10-7mol/L ICA+1 μg/mL MH組的鈣含量顯著高于其余各組(P<0.05)(圖5)。

圖4 各組BMSCs茜素紅染色

圖5 各組BMSCs中鈣含量半定量分析

3 討 論

種植體周圍炎所致的骨缺損是導致種植體修復失敗的重要原因。種植體周圍炎的發生與種植體齦下微生物菌群中的一些致病菌數量迅速增加密切相關，多種致病菌間的相互作用促進了種植體周圍炎的發生[7-8]。ICA是從中藥淫羊藿的主要有效成分，屬于黃酮苷類。已有研究表明，淫羊藿水提物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌表現出抑菌活性[9]，ICA與氨芐西林聯合使用可提高抗菌藥對耐藥金黃色葡萄球菌的抑制效果[5]，并且ICA對被高劑量萬古霉素抑制的成骨細胞具有促成骨特性，ICA有助于骨感染后的治療[10]。然而，對種植體周圍炎主要致病菌作用的相關報道較少，種植體周圍炎是一個混合厭氧感染，且微生物組成與慢性牙周炎齦下菌斑類似[11]。P.gingivalis是種植體周圍炎紅色復合體致病菌中檢出率最高的齦下致病優勢菌，是生物膜的晚期定植菌[12]。F.nucleatum可以與口腔許多細菌發生共聚，是生物膜早期定植菌和晚期定植菌共聚的連接橋，P.gingivalis和F.nucleatum與種植體周圍炎和牙周炎的發生密切相關[12-13]。因此，本研究選取這兩個菌種對ICA和MH聯合應用的抑菌性能進行實驗研究。

研究結果顯示，檢測濃度范圍內1×10-2～1×10-9mol/L，單藥ICA對P.gingivalis具有抑制作用，對F.nucleatum無抑制作用，MH對P.gingivalis和F.nucleatum均具有抑制作用，ICA和MH聯合應用對P.gingivalis表現出協同抑制作用，對F.nucleatum表現出相加抑制作用。文獻報道，MH通過附著在細菌30S核糖體亞基上阻止蛋白質合成，從而抑制細菌生長[14]。ICA與抗生素聯合應用增強對細菌的抑制作用可能是通過對黃酮類化合物主要結構的改變和修飾實現的[15]。本實驗結果表明ICA對部分種植體周圍炎治病菌具有抑制效果，ICA和MH聯合應用可增強抑菌效果，減少MH的藥物用量。

BMSCs在體外向成骨細胞方向誘導分化時，主要經歷以下幾個階段：轉化期、細胞增殖期、細胞聚集分泌期、細胞外基質鈣化期[16]。本研究選擇大鼠的BMSCs，檢測ICA和MH對細胞增殖、ALP活性、成骨分化相關基因mRNA的表達和細胞礦化的作用。CCK-8實驗結果顯示檢測范圍內不同濃度的ICA和MH對BMSCs的增殖均具有促進作用，其中1×10-8mol/L ICA 和1 μg/mL MH對BMSCs促增值的作用最強(P<0.05)。ALP是一種鈣結合轉運蛋白，促進細胞成熟、鈣化，可作為一個衡量BMSCs向成骨細胞分化的早期重要標記物[17]。本研究的結果顯示，1×10-7mol/L ICA顯著增強BMSCs的ALP活性，0.062 5、0.125、0.25和1 μg/mL MH對BMSCs的ALP活性均具有增強作用(P<0.05)。有研究報道，適宜抑菌濃度的MH能促進成骨細胞增殖和ALP活性表達[18]，這與本研究結果相似。MH促進ALP活性的原因可能是MH通過上調ALP和Runx2 mRNA表達水平，從而促進ALP的分泌。根據細胞增殖和ALP活性實驗結果，選用1×10-8、1×10-7mol/L ICA和1 μg/mL MH作為后續兩種藥物聯合應用對BMSCs促成骨分化作用實驗研究的藥物濃度。

本研究采用RT-PCR實驗檢測兩種藥物聯合應用對成骨相關因子Runx2、ALP、OCN和Col-1 mRNA表達水平的影響。實驗結果顯示相比于1 μg/mL MH單獨應用組，1×10-7mol/L ICA 和1 μg/mL MH聯合應用組Runx2、ALP、OCN和Col-1 mRNA的表達水平均顯著增高(P<0.05)。茜素紅染色結果顯示ICA 和MH聯合應用組的礦化結節數量相對較多。鈣含量半定量分析結果顯示，1×10-7mol/L ICA和1 μg/mL MH聯合應用組的鈣含量顯著高于其余各組(P<0.05)。以上實驗結果顯示，ICA與MH聯合應用可以增強對BMSCs促成骨分化效果，其中1×10-7mol/L ICA和1 μg/mL MH聯合應用促進BMSCs成骨分化效果最強。研究表明ICA可通過多種信號通路刺激BMSCs向成骨細胞分化，包括骨形態發生蛋白、絲裂原活化蛋白激酶、一氧化氮和典型的Wnt/β-catenin信號通路[19]。MH是一種已知的鈣螯合劑，能夠調節細胞微環境中的鈣水平。鈣信號通路在成骨分化過程中起著重要作用，推測MH通過影響鈣介導的信號轉導，改變細胞內外鈣水平，從而通過Smad-和Ras-介導的信號通路調節成骨分化過程[20]。本研究結果表明ICA和MH聯合應用可促進成骨相關因子Runx2和OCN mRNA的表達，但還需要通過更多的體內外實驗進一步探究ICA與MH聯合應用對BMSCs作用的分子機制，以及對種植體周圍炎治療的效果。

綜上所述，本研究通過體外實驗證實ICA與MH聯合應用可提高MH對P.gingivalis和F.nucleatum的抑制效果和對BMSCs促成骨分化效果。本研究初步探討ICA和MH聯合應用對種植體周圍炎致病菌和對間充質干細胞的作用，為種植體周圍炎的治療提供新思路。