LncRNA AC093818.1對口腔鱗癌細胞順鉑耐藥的影響及作用機制

孫艷艷 翁濤 林海燕 姬海蓮

順鉑(cisplatin,DDP)是一種廣泛使用的抗癌藥物，然而癌細胞對DDP耐藥顯著減弱口腔鱗癌化療的療效[1-2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種具有多種生物學功能的非編碼RNA[3-5]。研究表明lncRNA可以通過多種途徑參與腫瘤的發生與發展，并調控腫瘤對DDP耐藥[6-7]。研究顯示上調LncRNA CASC2C能夠通過抑制Wnt/β-catenin信號通路逆轉口腔癌DDP耐藥[8]。下調lncRNA HOST2能夠通過抑制PI3K/Akt信號通路增強卵巢癌細胞對DDP的敏感性[9]。此外，LncRNA NNT-AS1能夠通過MAPK/Slug信號通路調控非小細胞肺癌的DDP耐藥[10]。

LncRNA AC093818.1(AC09)作為一種天然反義長鏈非編碼RNA，最早被發現在卵巢癌組織中高表達[11]。Ba等[12]研究顯示AC09在胃癌組織高表達，過表達AC09能夠調控PDK1促進胃癌細胞的侵襲和遷移。本研究擬探討AC09對DDP的耐藥進程的影響，通過體內細胞實驗探討低表達AC09對口腔鱗癌耐藥細胞系增殖、凋亡的影響以及其潛在作用機制，為抵抗口腔鱗癌的DDP耐藥提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

人口腔鱗癌細胞系Tca-8113、CAL-27、SCC-25、SCC-090、DDP耐藥細胞系Tca-8113/DDP、CAL-27/DDP、人正常口腔上皮細胞NOK(中國科學院上海細胞庫)；qRT-PCR試劑盒、TRIZol試劑(上海聯邁生物工程有限公司)；NIBP、NF-κB p65、Ki-67、Caspase-3兔抗人多克隆抗體(上海研生生化試劑有限公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；CCK-8試劑盒、細胞凋亡試劑盒均(上海弗元生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養或轉染

將口腔鱗癌細胞系在含有10%FBS的DMEM培養基中培養，箱內溫度設置為37 ℃和5%CO2，細胞密度達到80%進行傳代。Tca-8113/DDP、CAL-27/DDP在相同培養液環境培養并加入0.2 mg/L DDP以維持其耐藥性，最終獲得能夠穩定傳代的耐藥細胞株。根據Tca-8113/DDP、CAL-27/DDP轉染質粒和藥物不同將實驗組分為DDP組(Ctrl+Cis，加入2.5 mg/mL DDP處理12 h)、si-NC+DDP組(si-NC+ Cis，轉染si-NC質粒和等濃度DDP處理)、si-AC09+DDP組(si-AC09+ Cis，轉染si-AC09質粒和等濃度DDP處理)，并設置空白對照組(Ctrl)。

1.3 qRT-PCR

采用TRIZol試劑提取口腔鱗癌細胞和DDP耐藥細胞中總RNA，參考試劑盒要求將總RNA合成cDNA。SYBRGreen實時熒光定量PCR(ABL公司，美國)檢測AC09、NIBP和NF-κB p65 mRNA表達水平，使用GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.4 CCK-8法

按照試劑盒要求對DDP耐藥細胞系增殖能力進行檢測。將細胞系接種到96 孔，分別在0、24、48、72 h時，向培養孔中加入10 μL的CCK-8溶液，孵育2 h后采用酶標儀測量450 nm波長光密度值。

1.5 流式細胞術

使用異硫氰酸熒光素(Annexin-V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑檢測DDP耐藥細胞的凋亡水平。收集細胞，PBS清洗2 次后，利用緩沖液重置，使用Annexin-V-FITC和PI對細胞在室溫和避光條件下反應10 min，使用流式細胞儀(Bio-Plex200,Bio-Rad公司,美國)細胞不同周期的凋亡率。

凋亡率=早期凋亡比例+晚期凋亡比例。

1.6 Western blot

使用RIPA緩沖液提取各組細胞中蛋白質，采用BCA法測量各組蛋白的蛋白量。首先分離蛋白質SDS-PAGE轉膜，在室溫條件下脫脂奶粉處理1 h。隨后加入NIBP、NF-κB p65、Ki-67、Caspase-3兔抗人多克隆抗體，于4 ℃溫度條件下孵育過夜。最后在次日加入抗小鼠Ig二抗孵育2 h，使用發光液曝光顯影。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 AC09在OSCC細胞系和DDP耐藥細胞系中表達水平上調

qRT-PCR結果顯示，口腔鱗癌細胞系Tca-8113、CAL-27、SCC-25和SCC-090中AC09的相對表達水平高于NOK中水平，差異具有統計學意義(P<0.05)。AC09在耐藥細胞系Tca-8113/DDP的相對表達量高于Tca-8113，在CAL-27/DDP的表達水平高于CAL-27。轉染si-AC09后，Tca-8113/DDP細胞系中AC09表達水平下降，CAL-27/DDP中AC09表達量也下調，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 OSCC細胞系和DDP耐藥細胞系中AC09的表達水平

2.2 低表達AC09抑制OSCC DDP耐藥細胞的增殖

采用CCK-8法檢測Tca-8113/DDP和CAL-27/DDP在不同組情況細胞增殖能力。結果顯示，與空白對照組比較，si-AC09組、DDP組和si-NC+DDP組的細胞增殖能力下降，Ki-67 mRNA表達水平下調。與si-NC+DDP組比較，si-AC09+DDP組的細胞增殖水平下調，Ki-67 mRNA表達水平下降。以上差異均具有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 Tca-8113/DDP細胞和CAL-27/DDP細胞在各組中的增殖能力

2.3 低表達AC09促進口腔鱗癌耐藥細胞的凋亡水平

流式細胞術分別檢測Tca-8113/DDP和CAL-27/DDP在不同組情況細胞凋亡水平的差異。Tca-8113/DDP中si-AC09組、DDP組和si-NC+DDP組的細胞凋亡水平高于空白對照組，Caspase-3 mRNA水平也高于空白對照組。而si-AC09+DDP組的凋亡水平高于si-NC+DDP組，Caspase-3 mRNA水平高于si-NC+DDP組。差異均具有統計學意義(P<0.05)(圖3)。CAL-27/DDP中si-AC09組、DDP組和si-NC+DDP組的細胞凋亡率高于空白對照組，Caspase-3 mRNA水平差異表現相似規律。而si-AC09+DDP組細胞凋亡率高于si-NC+DDP組，Caspase-3 mRNA水平差異表現相似規律，差異均具有統計學意義(P<0.05)(圖4)。

圖3 Tca-8113/DDP細胞在各組中的凋亡水平

圖4 CAL-27/DDP細胞在各組中的凋亡水平

2.4 低表達AC09抑制OSCC耐藥細胞中NF-κB信號通路的活化

采用qRT-PCR和Western bolt檢測口腔鱗癌親本細胞系和DDP耐藥細胞系中NF-κB通路相關蛋白的表達水平。結果顯示，耐藥細胞系轉染DDP或si-NC+DDP后，NIBP mRNA和蛋白水平升高，轉染si-AC09+DDP后，NIBP mRNA和蛋白水平下降，差異均具有統計學意義(P<0.05)(圖5)。與空白對照組比較，DDP組和si-NC+DDP組的NF-κB p65 mRNA和蛋白相對表達量升高。與si-NC+DDP組比較，si-AC09+DDP組的mRNA和蛋白相對表達量下調，以上差異均具有統計學意義(P<0.05)(圖6)。

圖5 NIBP在各組細胞中的表達水平

圖6 NF-κB p65在各組細胞中的表達水平

3 討 論

LncRNA是一種長度大于200nt的非編碼RNA[13-14]。近年研究發現lncRNA可作為抑癌或促癌基因參與腫瘤的發生與發展，包括增殖、侵襲、遷移、轉移等表型的機理和機制研究[15-16]。然而，lncRNA在口腔鱗癌的DDP耐藥機制研究尚處于起步階段，有待進一步探討[17]。研究表明LncRNA XIST可通過調控miR-27b-3p增加口腔鱗癌細胞DDP的化療敏感性[18]。LncRNA PVT1通過調控miR-194-5p/HIF1a軸參與口腔鱗癌細胞的增殖、侵襲和DDP化療耐藥[19]。本研究發現AC09在口腔鱗癌細胞中高于人正常口腔上皮細胞，口腔鱗癌細胞DDP耐藥系中AC09高于親本細胞系，低表達AC09后耐藥細胞系中AC09下調。這說明AC09可能參與口腔鱗癌對DDP的化療耐藥進程。

低表達AC09抑制口腔鱗癌耐藥細胞增殖，Ki-67 mRNA水平下降。低表達AC09后，口腔鱗癌耐藥細胞凋亡水平升高，caspase-3 mRNA水平升高。這說明低表達AC09抑制了口腔鱗癌耐藥細胞增殖、促進凋亡進程。同樣有研究顯示低表達MALAT1能夠抑制PI3K/AKT/m-TOR信號通路進而抑制口腔鱗癌細胞的侵襲、遷移和轉移[20]。然而，本研究側重于對AC09在口腔鱗癌DDP耐藥的影響。進一步的實驗表明，DDP耐藥細胞系中NIBP和NF-κB p65上調，而轉染si-AC09后表達水平下調，這說明低表達AC09抑制了DDP耐藥細胞中NIBP和NF-κB p65的表達水平。研究顯示口腔鱗癌細胞或組織中NF-κB通路被激活后，可誘導NF-κB通路的關鍵酶NIK、IKKβ形成NIBP，從而影響口腔鱗癌細胞增殖、分化進程，這提示NF-κB通路在口腔鱗癌的發生發展中具有重要作用[21]。因此，低表達AC09抑制口腔鱗癌DDP耐藥細胞中NF-κB通路的激活，從而抑制口腔鱗癌對DDP耐藥進程。

綜上所述，本研究發現低表達LncRNA AC093818.1通過抑制NF-κB通路延緩口腔鱗癌對DDP的耐藥性，AC093818.1可能成為抵抗口腔鱗癌DDP耐藥的潛在靶點。