過氧甲酸預處理對甘蔗渣酶解和發酵的影響

李 寧, 孟繁陽, 楊海艷,2, 史正軍,2, 趙 平,2, 楊 靜,2*

(1.西南林業大學 化學工程學院,云南 昆明 650224; 2.云南省高校特色林木生物質資源化學利用重點實驗室,西南林業大學,云南 昆明 650224)

能源短缺和環境惡化使得尋求一種清潔、可再生的綠色能源成為我國基礎工業領域的重要任務之一。據統計，全球的生物質年產量約 1 100 億噸，其中木質纖維原料(如農林剩余物的秸稈、木屑和工業廢棄物甘蔗渣等)占生物質資源總量的 80%以上[1]。合理利用廢棄的木質纖維原料對解決能源和環境問題起著重要的作用。甘蔗渣是制糖工業的副產物，其成分纖維素、半纖維素可被水解為單糖，繼而發酵成為燃料乙醇[2-3]。然而木質纖維中的纖維素、半纖維素和木質素會相互包裹形成致密結構的物理屏障，且木質素與半纖維素會形成木質素-碳水化合物復合物(LCC)，使得三大組分難以分離，無法高值化利用[4]。對生物質進行預處理是除去這種天然抗降解屏障的有效方法[5]。預處理可以降低纖維素的結晶度，增加木質纖維原料的多孔性，脫除木質素和半纖維素的保護作用，增加木質纖維酶解過程中酶與木質纖維的可及性，從而提高后續的酶解效率。目前甲酸法脫木質素已經比較常見，但僅用甲酸脫木質素并不是最佳的選擇，因為隨著甲酸濃度的提高，木質素的縮合反應會增加，大量的碳水化合物被降解，影響后續酶解葡萄糖得率[6]。而相較甲酸預處理，過氧甲酸預處理酸性更強，在溫和條件下即可脫除大量木質素，提高酶解得率[7]。本研究對甘蔗渣先進行過氧甲酸預處理，然后經酶解后進行發酵，研究預處理對甘蔗渣酶解和乙醇得率的影響，以期為木質纖維高值化利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗渣(SCB)，購于云南孟連昌裕糖業有限公司，粉碎至0.250～0.380 mm，備用。纖維素酶(Cellic CTec2)，購于美國Sigma公司，其濾紙酶活250 FPIU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活71.54 IU/mL；酵母膏(生物試劑)，北京奧博星生物技術有限公司；釀酒酵母(高活性干酵母)，安琪酵母股份有限公司；考馬斯亮藍，廣州賽國生物科技有限公司；過氧化氫(HPP)、甲酸(FAP)、葡萄糖等均為市售分析純。

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent Technologies公司；KX-500A粉碎機，浙江武義鼎藏日用金屬制品；TDL-5-A低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；Micromeritics ASAP系列比表面積分析儀，上海 Micromeritics公司；THZ-98C恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司；D/MAX 2500PC型X射線衍射儀，日本Rigaku公司；TU-1901雙光束紫外可見分光，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 甘蔗渣的過氧甲酸預處理

分別取SCB 10 g，按固液比1 ∶15(g ∶mL)加入不同濃度的過氧甲酸(HPP與FAP體積比為1 ∶1、 1 ∶4和1 ∶8)，室溫(25±2) ℃條件下反應2 h，然后用蒸餾水洗滌至中性，分別命名為PAP-SCB-1、PAP-SCB- 4和PAP-SCB-8。單獨FAP和HPP預處理的SCB作為對照樣，命名為FAP-SCB、HPP-SCB。

1.3 甘蔗渣的纖維素酶水解

取預處理后的SCB 1 g，加入適量自制的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(另含0.093 mol/L NaOH)調節 pH 值至4.8，纖維素酶用量為 10 FPIU/g(以預處理后甘蔗渣質量計)，水解體系為20 mL,在50 ℃、 150 r/min條件下水解72 h。水解液離心去除固體殘渣后得上清液，于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌 30 min，冷卻備用。

分別于2、 4、 6、 10、 24、 48和72 h時取少量水解上清液進行稀釋[8]，采用高效液相色譜(HPLC)儀測定其糖組分， Bradford法[9]測定其游離纖維素酶蛋白含量。葡萄糖和木糖得率按文獻[10]的方法計算，見式(1)和式(2):

Y1=(C1×0.9×0.02)/(m×ω1)×100%

(1)

Y2=(C2×0.88×0.02)/(m×ω2)×100%

(2)

式中:Y1—葡萄糖的得率，%；C1—水解液中葡萄糖質量濃度，g/L； 0.9—纖維素和葡萄糖的轉化系數； 0.02—水解液的體積，L；m—SCB的質量，g；ω1—SCB中纖維素的質量分數，%；Y2—木糖得率，%；C2—水解液中木糖質量濃度，g/L； 0.88—半纖維素和木糖的轉化系數；ω2—SCB中半纖維素的質量分數，%。

1.4 甘蔗渣水解后上清液的發酵

按0.05 g/mL稱取葡萄糖若干，按0.1 g/mL稱取酵母膏適量，將兩者混合，加入0.216 g釀酒酵母，35 ℃活化30 min，制備成8 mL的酵母溶液。取4 mL1.3節水解72 h后的水解上清液，加入0.5 mL酵母溶液，35 ℃ 發酵24 h[11]。使用高效液相色譜儀測定發酵液中乙醇質量濃度，并計算乙醇得率。乙醇得率按文獻[12]的方法計算，見式(3):

Y=C/(CG×0.51)×100%

(3)

式中:Y—乙醇得率，%；C—乙醇質量濃度，g /L；CG—發酵液中葡萄糖初始質量濃度，g/L； 0.51—葡萄糖轉化乙醇的理論值。

1.5 分析測定

1.5.1物料組分測定 甘蔗渣預處理前后的主要成分(葡萄糖、木聚糖、木質素和纖維素)測定根據國家標準方法分析[13]。固體回收率、纖維素回收率和木質素脫除率按式(4)～式(6)計算。

η0=m′0/m0×100%

(4)

η=m′1/m1×100%

(5)

φ=(1-m′2/m2)×100%

(6)

式中:η0、η—分別為固體和纖維素回收率，%；φ—木質素脫除率，%；m′1、m′2—分別為預處理甘蔗渣中纖維素和木質素質量，g；m′0、m0—分別為預處理和未處理甘蔗渣質量，g；m1、m2—分別為未處理甘蔗渣中纖維素和木質素質量，g。

1.5.2蛋白質濃度測定 采用 Bradford 法[9]測定預處理甘蔗渣酶水解上清液中蛋白質濃度。取0.1 mL 水解上清液加入2 mL考馬斯亮藍溶液，室溫下反應5 min，595 nm下測定紫外吸光值，以同樣方法處理蒸餾水作為對照，根據標準曲線計算樣品蛋白質濃度。

1.5.3比表面積測定 采用BET法(氮吸附法)[14]測定預處理后甘蔗渣的比表面積。

1.5.4X射線衍射分析 采用X射線衍射(XRD)儀對預處理甘蔗渣進行分析[15]。預處理甘蔗渣經照射后，內部定型或無定型結構會發生衍射而產生不同特征峰，通過結晶峰面積與總面積的比率可計算出其內部纖維素結構變化，計算方法見式(7)：

Ic=(I002-Ia) /I002×100%

(7)

式中:Ic—結晶度指數，%；I002—2θ為22.5°對應的002晶面的最大衍射強度；Ia—2θ為16°對應的非結晶背景衍射強度。

2 結果與分析

2.1 過氧甲酸預處理對甘蔗渣化學成分和結構特征的影響

2.1.1甘蔗渣化學成分 甘蔗渣(SCB)在室溫(25±2) ℃下，經不同濃度過氧甲酸預處理2 h后的化學成分變化如表1所示，實驗以甘蔗渣原料、單獨過氧化氫預處理甘蔗渣(HPP-SCB)、單獨甲酸預處理甘蔗渣(FAP-SCB)為對照組進行對比分析。

從表1可知，SCB含葡聚糖、木聚糖和木質素分別為46.36%、 22.51%和21.27%。經單獨過氧化氫和單獨甲酸預處理后，木聚糖含量沒有明顯變化，但木質素的量降低，HPP-SCB和FAP-SCB的木質素脫除率分別為10.06%和12.55%。甘蔗渣經不同體積比(V(HPP) ∶V(FAP)分別為1 ∶1，1 ∶4和1 ∶8)的過氧甲酸預處理后，盡管木聚糖含量未發生明顯變化，但木質素均低于10%。當V(HPP) ∶V(FAP)為1 ∶1時，預處理甘蔗渣(PAP-SCB-1)中木質素的量為3.34%，木質素脫除率為84.30%，相比過氧化氫單獨預處理和甲酸單獨預處理分別提高了74.24和71.75個百分點，木質素的脫除有利于甘蔗渣的后續酶解糖化過程。由表1中數據可以看出，隨著過氧甲酸中過氧化氫比例的降低，木質素脫除率降低，可能是因為甲酸濃度的增加，甘蔗渣表面的木質素會發生縮聚，從而導致PAP-SCB- 4中木質素含量較PAP-SCB-1略微增加[16]。Bu等[17]研究發現，進行過氧甲酸預處理，甘蔗渣中纖維素損失很小(9.20%)，木質素被顯著去除(59.00%)，且預處理甘蔗渣獲得了完全糖化。

表1 不同濃度過氧甲酸預處理對甘蔗渣化學成分的影響1)

1)SCB:未處理甘蔗渣untreated sugarcane bagasse; HPP:過氧化氫預處理hydrogen peroxide pretreatment; FAP:甲酸預處理formic acid pretreatment; PAP-SCB-1、PAP-SCB- 4、PAP-SCB-8:分別采用過氧化氫與甲酸體積比1 ∶1、 1 ∶4和1 ∶8的比例對甘蔗渣進行預處理 pretreatment of bagasse with volume ratio of hydrogen peroxide to formic acid of 1 ∶1, 1 ∶4 and 1 ∶8, respectively; 下同the same as in the following

2.1.2比表面積分析 甘蔗渣經不同濃度過氧甲酸預處理2 h后的BET比表面積測定結果如圖1所示。甘蔗渣經過氧化氫單獨預處理和甲酸單獨預處理后，其比表面積從未處理的0.09 m2/g(SCB)增至1.141 8 m2/g(FAP-SCB)和1.220 1 m2/g(HPP-SCB)，這表明無論是過氧化氫還是甲酸均可溶出甘蔗渣中的少量木質素，使得甘蔗渣孔隙度增大，從而比表面積增大。由圖1還可以看出甘蔗渣經過氧甲酸預處理后，比表面積明顯增加。PAP-SCB-1比表面積增至13.01 m2/g，分別是HPP-SCB的10.66倍和FAP-SCB的11.39倍；當過氧甲酸中甲酸用量增加時，預處理后的甘蔗渣比表面積下降明顯，PAP-SCB- 4和PAP-SCB-8的比表面積僅分別為6.36和3.23 m2/g。這是因為過氧甲酸預處理脫除甘蔗渣中的大量木質素，使得甘蔗渣比表面積大大增加，進而可使甘蔗渣與纖維素酶接觸面積增大，酶可及度提高。Wu等[18]研究也發現竹材經結構改性，其木質素的脫除可使物料比表面積增大。

2.1.3XRD分析 除了木質素的阻礙作用，纖維素結晶度也是影響木質纖維酶解糖化的重要因素。甘蔗渣經不同濃度過氧甲酸預處理2 h后的XRD分析結果如圖2所示。

2θ為22.5°出現的高峰為纖維素晶面指數002的衍射峰，2θ為16°處的衍射峰代表甘蔗渣的無定型區部分，包括無序纖維素、半纖維素和木質素[19]。由圖可知，未處理甘蔗渣結晶度為42.64%，經HPP單獨預處理和FAP單獨預處理后，結晶度增加至48.86%和47.19%，結合表1化學成分結果，分析可知主要原因是少量木質素被脫除，無定型區部分溶解，但未對纖維素結晶區造成破壞[20]。甘蔗渣經不同濃度的過氧甲酸預處理后，結晶度進一步提高到54.18%(PAP-SCB-1)、 52.44%(PAP-SCB- 4)、 52.39%(PAP-SCB-8)，但甘蔗渣結晶指數未隨著過氧甲酸中過氧化氫用量的變化而變化，這表明經過氧甲酸預處理后甘蔗渣中雖然大量木質素被脫除了，但過氧甲酸只作用于甘蔗渣中纖維素的無定型區和結晶區表面，纖維素晶體類型未發生變化。

2.2 過氧甲酸預處理對甘蔗渣水解、發酵和水解液中纖維素酶分布的影響

2.2.1葡萄糖和木糖得率 1 g預處理后的甘蔗渣在酶用量 10 FPIU/g、 pH 值4.8、 50 ℃條件下水解72 h，其葡萄糖和木糖得率如圖3所示。由圖可知，HPP-SCB的葡萄糖和木糖得率分別為9.11%和5.25%，FAP-SCB的葡萄糖和木糖得率分別為7.06%和4.89%。由數據可知，兩者的酶解效率極低，這是因為單獨HPP或FAP預處理對木質素脫除甚少，對提高后續酶解效率沒有明顯的作用。甘蔗渣經過氧甲酸預處理后，葡萄糖得率和木糖得率均明顯提高。PAP-SCB-1酶解72 h時的葡萄糖得率達到98.71%，比單獨HPP或FAP預處理分別提高了89.60和91.65個百分點；木糖得率達到91.05%，比單獨HPP或FAP預處理分別提高了85.80和86.16個百分點。由于過氧甲酸預處理脫除了甘蔗渣中的絕大部分木質素，使得預處理后的甘蔗渣比表面積增大， 即纖維素酶對預處理后的甘蔗渣的可及性增加，酶解效率顯著增加。此外，從圖中還可以看出，當過氧化氫和甲酸的比例為1 ∶4和1 ∶8時，酶解72 h時葡萄糖得率為 67.98%(PAP-SCB- 4)和44.33%(PAP-SCB-8)，葡萄糖得率隨過氧甲酸中甲酸用量增加而降低，這可能是因為甲酸濃度增大，甘蔗渣表面木質素發生再次縮聚，導致木質素含量略微增加，進而在酶水解過程中產生非生產性吸附，影響后續酶解糖化得率[16]。

a.葡萄糖glucose； b.木糖xylose

2.2.2乙醇得率 利用釀酒酵母發酵，可將葡萄糖轉化為乙醇，完成糖類到乙醇的生物轉化。將預處理甘蔗渣酶水解72 h后的水解上清液接入酵母進行 24 h發酵，其乙醇質量濃度和乙醇得率如表2所示。由表可知， HPP-SCB酶解液發酵后，乙醇質量濃度和得率分別為2.95 g/L和76.20%； FAP-SCB酶解液發酵后，乙醇質量濃度和得率分別為2.81 g/L和75.15%。而經過氧甲酸預處理的甘蔗渣酶水解液發酵后，乙醇質量濃度和轉化率明顯提高。PAP-SCB-1發酵后乙醇質量濃度和乙醇得率分別為17.10 g/L和84.06%，表明過氧甲酸預處理可提高甘蔗渣酶解得率，使水解上清液中葡萄糖濃度增大，從而改善發酵效果。此外，從表中可以看出，過氧化氫和甲酸比例由1 ∶1增加到1 ∶4和1 ∶8 時，乙醇質量濃度有所下降,主要是因為隨著過氧化氫含量的減少，葡萄糖酶解效率逐漸降低，且在發酵過程中可能產生了抑制乙醇發酵的物質如糠醛、羥甲基糠醛等，導致乙醇得率下降。

表2 不同濃度過氧甲酸預處理對甘蔗渣酶解液發酵的影響

2.2.3水解液中纖維素酶的分布 預處理甘蔗渣進行72 h酶水解，收集不同時間點的上清液，通過Bradford法測定上清液中蛋白質質量分數的變化，分析纖維素酶的分布情況，結果如圖4所示。反應開始(2 h)時，大量的纖維素酶蛋白快速吸附到木質素上，導致上清液中蛋白質質量分數迅速下降，從圖中可以看出，反應 6 h時，SCB水解體系中蛋白質質量分數為初始蛋白質量分數的36.30%。HPP-SCB和 FAP-SCB 水解上清液中的平均蛋白質量分數分別為初始蛋白質量分數的27.48%和27.96%，經過氧甲酸預處理后的甘蔗渣水解液中蛋白質質量分數進一步降低，其中PAP-SCB-1在6 h時水解上清液中的蛋白質質量分數下降至41.52%，表明經過氧甲酸預處理脫除了大量木質素后，甘蔗渣對酶的吸附能力增強。水解12 h時，PAP-SCB-1的水解液中酶蛋白質量分數達到了55.00%左右，較HPP-SCB和FAP-SCB分別提高了15.00%和11.00%，可能是因為在水解過程中，纖維素與纖維素酶之間屬于可逆吸附，纖維素酶蛋白再次吸附到了PAP-SCB上，而HPP-SCB、FAP-SCB由于木質素脫除少，部分纖維素酶在木質素上發生無效吸附，導致酶解效率低[21]。

圖4 預處理對甘蔗渣酶解過程中上清液蛋白質質量分數的影響Fig.4 Effect of pretreatmeat on protein content of supernatant during enzymatic hydrolysis of SCB

水解72 h 后，HPP-SCB和 FAP-SCB水解上清液中的酶蛋白質量分數分別為初始蛋白質量分數的27.54%和33.66%，與水解初期的蛋白質量分數相比變化不大，說明大量的纖維素酶可逆吸附于木質素上，沒有參加纖維素水解反應，故HPP-SCB和 FAP-SCB酶水解72 h時，葡萄糖得率均小于10%。而PAP-SCB-1酶水解72 h時，上清液酶蛋白質量分數為55.02%，這主要是因為甘蔗渣經PAP預處理后，大部分木質素被脫除，木質素沒有與纖維素競爭吸附酶蛋白，使更多的纖維素酶參與到甘蔗渣的水解過程。這使甘蔗渣在酶的作用下水解更充分。因此，PAP-SCB-1水解72 h后葡萄糖和木糖得率分別達到98.71% 和91.05%(圖3)。這與微晶纖維素酶水解過程中的纖維素酶蛋白在底物木質素上呈現出的“吸附-催化-解吸附-再吸附”結論相一致[22]。

3 結 論

3.1對甘蔗渣先進行過氧甲酸預處理，然后加入纖維素酶進行水解，并將水解液用于發酵產乙醇。研究結果表明：過氧甲酸預處理有利于甘蔗渣中木質素的脫除，當過氧化氫和甲酸的體積比為1 ∶1時，預處理后的甘蔗渣PAP-SCB-1的木質素脫除率為84.30%。由于木質素脫除使得甘蔗渣無定型區部分溶解和孔隙率增加，因而PAP-SCB-1的結晶度和BET比表面積提高到54.18%和13.01 m2/g。

3.2在纖維素酶用量為10 FPIU/g(以預處理后的甘蔗渣質量計)時，PAP-SCB-1水解72 h時,其葡萄糖得率為98.71%，分別是HPP-SCB的10.84倍和FAP-SCB的13.98倍；水解12 h時，水解液中酶蛋白質量分數為55.00%，較相同條件下的HPP-SCB和FAP-SCB分別提高了15.00%和11.00%，這是因為甘蔗渣經PAP預處理后，大部分木質素被脫除，纖維素與纖維素酶發生可逆吸附，提高了酶解效率。

3.3過氧甲酸預處理有利于發酵糖類到生物乙醇的轉化，PAP-SCB-1水解72 h后的水解液經24 h發酵可得到乙醇質量濃度和得率分別為17.10 g/L和84.06%，較 HPP-SCB(2.95 g/L 和76.20%)和FAP-SCB(2.81 g/L和75.15%)提升明顯。