不同丙酸濃度對天然牧草青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響

張佳偉， 賈玉山*， 格根圖， 王志軍， 包 健， 李宇宇， 彭 冬， 王 宇， 孫鵬波， 岳曉明

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019； 2.烏海市檢驗檢測中心， 內(nèi)蒙古 烏海市 016000； 3.烏拉蓋管理區(qū)綠野草業(yè)有限公司， 內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000)

當(dāng)前畜牧業(yè)快速發(fā)展導(dǎo)致飼草料的需求不斷增加，同時我國天然草地資源豐富，據(jù)統(tǒng)計天然草地中具有飼用價值的牧草高達6 000余種，優(yōu)勢飼用牧草也有300余種[1]，可為飼草料的需求提供更多來源。放牧和刈割是天然草地的主要利用方式[2]，刈割后的牧草可進行干草調(diào)制或進行青貯利用，干草調(diào)制是目前草原牧區(qū)的主要貯藏利用方式，由于干草調(diào)制受到多方面因素的影響，使得牧草營養(yǎng)的損耗非常大[3]。不當(dāng)?shù)馁A藏方式會造成牧草發(fā)生霉?fàn)€變質(zhì)現(xiàn)象，浪費極為嚴(yán)重。青貯可以更好的保存牧草的營養(yǎng)成分，提高利用率，是一種較為高效的牧草加工貯藏方式。然而，相較于其他牧草，天然牧草存在一定的調(diào)制問題，其具有較高的緩沖能值和較低的乳酸菌附著量、含水量、WSC含量[4]，青貯過程中pH值難以降低，使腐敗細(xì)菌大量滋生，導(dǎo)致有氧穩(wěn)定性降低，容易腐敗變質(zhì)。為克服這個問題，需要制定能夠有效抑制發(fā)酵過程中腐敗和不良微生物生長、改善營養(yǎng)保存、延長青貯飼料有氧穩(wěn)定性的策略。

青貯飼料有機酸添加劑可以抑制青貯發(fā)酵過程中不良微生物的生長，提高青貯飼料品質(zhì)，防止青貯飼料有氧變質(zhì)，有機酸添加劑在青貯飼料調(diào)制中已廣泛應(yīng)用[5-6]。丙酸作為有機酸添加劑之一，在青貯飼料中已表現(xiàn)出優(yōu)異效果。研究表明，在雜交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purpureum)青貯中添加丙酸可以降低青貯飼料中的pH值，有效抑制不良微生物的活動，從而阻止了不良微生物對CP的降解及WSC的利用，使青貯飼料中CP及WSC含量提升，促進發(fā)酵，提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[7]。在其他青貯原料中丙酸添加劑也已廣泛應(yīng)用[8-9]，對于青貯品質(zhì)的改善都具有優(yōu)異效果。另一方面丙酸可作為干草防霉劑抑制微生物的活動和植物細(xì)胞的代謝，使干草貯藏過程中的溫度、pH值及霉菌和酵母菌的數(shù)量降低，CP和WSC的含量提高[10]，使干草的營養(yǎng)成分在貯藏中得以良好的保存。在有氧穩(wěn)定性方面，丙酸可抑制青貯飼料在有氧暴露過程中霉菌和酵母菌的生長[11-12]，改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

目前，對天然牧草青貯的研究大多集中在切割長度、填裝密度、含水量、添加劑種類對天然牧草青貯品質(zhì)的影響方面[13-15]，關(guān)于丙酸作為青貯添加劑的研究主要集中在對于全株玉米(Zeamays)、燕麥(Avenasativa)、紫花苜蓿(Medicagosativa)等人工飼草作物的青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性方面[16-18]，另一方面在干草貯藏中丙酸常作為干草防霉劑使用[19-20]。關(guān)于丙酸對天然牧草青貯品質(zhì)、有氧穩(wěn)定性的影響以及丙酸適宜添加濃度篩選的研究較少，因此本試驗探究了丙酸添加量對天然牧草青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響，旨在為提高天然牧草青貯品質(zhì)及降低其有氧暴露階段好氧敗壞提供理論依據(jù)及實踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料：天然牧草于2021年8月1日刈割自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟毛登牧場典型草原天然打草場，刈割后用鍘刀切為2 cm左右小段，混合均勻，作為青貯原料待用。當(dāng)?shù)夭萑航Y(jié)構(gòu)主要以羊草(Leymuschinensis，占總蓋度27.8%)和大針茅(Stipagrandis，占總蓋度21.6%)為主,試驗區(qū)植物群落調(diào)查情況具體見表1。

添加劑：丙酸為分析純，購于上海麥克林生化科技責(zé)任有限公司。

表1 試驗地植物群落調(diào)查表Table 1 Questionnaire of plant communities in experimental sites

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機設(shè)計，設(shè)對照組和3個不同丙酸濃度添加劑處理組，以天然牧草鮮重為基礎(chǔ)，按每包為250 g的標(biāo)準(zhǔn)，以0 mL·kg-1，2 mL·kg-1，4 mL·kg-1，6 mL·kg-1添加量為分組依據(jù)。稱取對應(yīng)量的丙酸，分別加10 mL蒸餾水混合均勻后噴施至稱量好的青貯原料中，各處理組命名為：0 mL·kg-1丙酸添加組(CK)、2 mL·kg-1丙酸添加組(T1)、4 mL·kg-1丙酸添加組(T2)、6 mL·kg-1丙酸添加組(T3)。每個處理設(shè)置6個重復(fù)，其中3個重復(fù)用于有氧穩(wěn)定性的測定。將處理好的樣品裝入聚乙烯袋中，用塑封機進行真空包裝后置于室溫下保存，發(fā)酵60 d后開袋取樣測定青貯飼料的營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)、微生物數(shù)量及有氧穩(wěn)定性。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1營養(yǎng)品質(zhì) 干物質(zhì)(Dry matter，DM)含量采用烘干法進行測定[21]，將青貯樣品置于電熱鼓風(fēng)干燥箱105℃殺青30 min后于65℃烘干48 h，準(zhǔn)確稱量，計算干物質(zhì)含量；粗蛋白質(zhì)(Crude protein，CP)含量采用杜馬斯燃燒法進行測定[21]；可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates，WSC)采用蒽酮-硫酸比色法進行測定分析[22]；酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)含量采用ANKOM全自動纖維分析儀進行測定[23]。粗脂肪(Ether extract，EE)采用索氏脂肪提取法測定[24]；粗灰分(Crude ash，Ash)利用灼燒法進行測定[25]。

1.3.2發(fā)酵品質(zhì) 青貯樣品開袋后，稱取10 g樣品于聚乙烯無菌拍打袋中，加入90 mL無菌蒸餾水，使用拍打式無菌均質(zhì)器拍勻后過濾，濾液置于50 mL離心管內(nèi)，用于pH值、微生物數(shù)量、有機酸及氨態(tài)氮的測定。pH值采用便捷式pH計進行測定[26]；乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PA)、丁酸(Butyric acid,BA)采用高效液相色譜儀測定[27]；氨態(tài)氮采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[28]。

1.3.3微生物數(shù)量 微生物數(shù)量采用平板計數(shù)法測定[29]，將上述濾液按10倍稀釋法依次稀釋為10-1，10-3，10-5，測定青貯飼料中乳酸菌(Lactic acid bacteria)、一般好氧性細(xì)菌(Aerobic bacteria)、大腸桿菌(Coliform)、酵母菌(Yeasts)和霉菌(Molds)數(shù)量。其中乳酸菌在MRS固體培養(yǎng)基35℃厭氧培養(yǎng)48 h后計數(shù)；一般好氧性細(xì)菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)；大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)；酵母菌和霉菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。所有微生物數(shù)據(jù)采用lg cfu·g-1of FM表示。

1.3.4有氧穩(wěn)定性 青貯飼料開袋后，將青貯飼料約250 g混勻后放入1 L聚乙烯無菌罐中，插入多通道溫度記錄儀探頭，測定青貯飼料溫度和環(huán)境溫度變化，當(dāng)青貯飼料中溫度高于環(huán)境溫度2℃時說明青貯飼料發(fā)生了腐敗變質(zhì)[30]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)前期采用Excel 2019軟件進行初步處理，采用SAS9.4軟件進行單因素方差分析，并用Duncan法對各處理的均值進行多重比較，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料營養(yǎng)品質(zhì)分析

由表2可知，天然牧草青貯原料DM含量為51.21%，ADF與NDF含量分別為35.06%，68.55%，WSC與CP含量分別為6.38%，8.30%，EE含量為2.79%，Ash含量為5.30%。乳酸菌含量較低，為0.54 lg cfu·g-1FW，一般好氧性細(xì)菌含量為7.14 lg cfu·g-1FW，酵母菌和霉菌含量均為3.77 lg cfu·g-1FW，青貯原料中未檢測出大腸桿菌。

表2 天然牧草原料營養(yǎng)品質(zhì)及微生物數(shù)量Table 2 Nutritional quality and microbial quantity of natural forage raw materials

2.2 丙酸濃度對天然牧草青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表3可知，CK的DM含量顯著低于T2與T3 (P<0.05),而與T1的DM含量無顯著差異；T1與T3的CP含量顯著高于CK (P<0.05)，而T2的CP含量與CK無顯著差異；T3的NDF含量顯著低于其余各組(P<0.05)；T1與T2的ADF含量均顯著低于CK (P<0.05)，而T3處理組ADF含量與CK無顯著差異；T1的Ash含量顯著高于CK (P<0.05)，而T2與T3的Ash含量與CK無顯著差異；與CK相比，各丙酸濃度處理組WSC含量均顯著提高(P<0.05)，且T2與T3的WSC含量顯著高于T1(P<0.05)。

表3 不同丙酸濃度對天然牧草青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 3 Effects of different propionic acid concentrations on nutrient quality of natural forage silage

2.3 丙酸濃度對天然牧草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表4可知，各丙酸濃度處理組pH值均顯著低于CK(P<0.05)，在T1中為最低；各丙酸濃度處理組乳酸含量均高于CK，其中T1中乳酸含量顯著高于其他處理組(P<0.05)；乙酸含量在T1與T3中均高于CK，在T2中低于CK；在T2與T3中檢測到少量丙酸，在CK與T1中均未檢測到丙酸；在各處理組中均未檢測到丁酸；各處理組的氨態(tài)氮：總氮含量均無顯著差異。

表4 不同丙酸濃度對天然牧草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 4 Effects of different propionate concentrations on fermentation quality of natural forage silage

2.4 丙酸濃度對天然牧草青貯微生物數(shù)量影響

由表5可知，各丙酸濃度處理組乳酸菌數(shù)量均顯著高于CK(P<0.05)，其中T1達最大值，為5.34 lg cfu·g-1；各丙酸濃度處理組一般好氧性細(xì)菌數(shù)量均顯著低于CK(P<0.05)，其中T3達最小值，為4.38 lg cfu·g-1；各丙酸濃度處理組大腸桿菌數(shù)量均顯著低于CK(P<0.05)，其中T3達最小值，為4.04 lg cfu·g-1；各丙酸濃度處理組酵母菌數(shù)量均低于CK，其中T3顯著低于CK(P<0.05)，為4.47 lg cfu·g-1；各處理組中均未檢出霉菌。

表5 不同丙酸濃度對天然牧草青貯微生物數(shù)量的影響Table 5 Effects of Different Concentrations of Propionic Acid on Microbial Population in Natural Forage Silage

2.5 丙酸濃度對天然牧草青貯有氧穩(wěn)定性的影響

不同丙酸濃度對天然牧草青貯有氧穩(wěn)定性的影響評價結(jié)果如圖1所示，CK處理組、T1處理組、T2處理組、T3處理組天然牧草青貯發(fā)生有氧變質(zhì)時間分別為156 h，268 h，302 h，286 h，T1處理組、T2處理組、T3處理組天然牧草青貯有氧穩(wěn)定性時間較CK處理組分別提高了71.79%，93.59%，83.33%。

圖1 不同丙酸濃度對天然牧草青貯有氧穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effects of different propionate concentrations on aerobic stability of natural forage silage

3 討論

3.1 丙酸濃度對天然牧草青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響

天然牧草青貯是保障我國牧區(qū)畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的關(guān)鍵，可使天然草地的牧草得以充分利用，同時使牧區(qū)家畜在冬季能夠采食到鮮綠飼草，有效保留牧草營養(yǎng)價值。優(yōu)質(zhì)青貯飼料一般具有較高的CP含量和較低ADF與NDF含量。天然牧草因生長在特殊的環(huán)境且為混合草群，導(dǎo)致乳酸菌數(shù)量附著較少、WSC含量較低、含水量較低、緩沖能值較高，直接青貯很難成功[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，天然牧草青貯中添加不同濃度丙酸使CP含量均有提高。劉庭玉等[32]以赤峰市草甸草原天然牧草為原料，添加有機酸添加劑甲酸青貯后發(fā)現(xiàn)CP含量較對照組提高了60%以上，因為甲酸的加入能夠快速降低天然牧草青貯飼料pH值，抑制不良微生物對CP的分解，降低CP的流失，這與本研究結(jié)果相似，說明有機酸添加劑可以較好的保存青貯飼料的CP；添加不同濃度丙酸均使DM含量高于CK，其中T2與T3顯著高于CK，丙酸的添加抑制了不良微生物的生長，保存了發(fā)酵底物，使干物質(zhì)損失率降低，這與李平等[33]研究結(jié)果一致；添加不同濃度丙酸均使青貯飼料中WSC含量提高，這與張靜等[34]研究結(jié)果一致，因為添加丙酸能夠抑制一些有害微生物的活性，如酵母菌、霉菌等，使它們對WSC的消耗減少，同時為乳酸菌的發(fā)酵提供更多的底物[35]，促進乳酸發(fā)酵；添加不同濃度丙酸均不同程度降低天然牧草ADF和NDF含量，這與Zhang[36]的研究結(jié)果不同，可能是原料特性不同導(dǎo)致，本研究中ADF和NDF含量降低原因可能是青貯發(fā)酵過程中細(xì)胞壁組分的酶解和酸解共存的結(jié)果[16]。李茂等[37]在木薯葉青貯中加入了丙酸添加劑，結(jié)果表明ADF含量與NDF含量均顯著降低，與本研究結(jié)果一致。說明添加丙酸可以一定程度避免青貯飼料中營養(yǎng)的流失，保存天然牧草青貯飼料的營養(yǎng)價值。

3.2 丙酸濃度對天然牧草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

優(yōu)質(zhì)青貯飼料應(yīng)具有較高乳酸含量的同時具有較低的pH值。低pH值有助于青貯飼料在厭氧儲存期間保持穩(wěn)定的條件。本研究發(fā)現(xiàn)，各丙酸濃度處理組與CK相比，均顯著降低了pH值、增加乳酸含量，這是因為丙酸可以有效地抑制有害微生物的生長繁殖，從而使天然牧草青貯過程中乳酸菌成為優(yōu)勢菌種，產(chǎn)生大量的乳酸與乙酸以使pH值顯著降低，提高發(fā)酵品質(zhì)。李平等[38]在老芒麥(Elymussibiricus)青貯中添加丙酸后發(fā)現(xiàn)其pH值、ADF含量降低，乳酸含量增加，這與本研究結(jié)果一致，說明丙酸能夠改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。而添加過量丙酸可能抑制乳酸菌對WSC的利用，導(dǎo)致T2，T3中乳酸含量較T1降低。與對照組相比，各添加劑處理組均不同程度的提高了乙酸含量，其中T3乙酸含量最高，乙酸含量在各處理組均高于乳酸含量，可能是因為天然牧草表面附著乳酸菌大多為異型發(fā)酵乳酸菌，從而產(chǎn)生了大量乙酸。在T2與T3中檢測到了丙酸，而在T1中未檢測到丙酸，由于丙酸具有強揮發(fā)性，可能是在試驗初期青貯制作時，在噴施添加劑過程中揮發(fā)了部分丙酸，導(dǎo)致添加濃度最低的T1未檢測到丙酸含量。在CK處理組未檢測到丙酸，而在T2，T3處理組中檢測到較多量的丙酸，說明大部分丙酸是由外源添加產(chǎn)生，而少量的是由于天然牧草青貯發(fā)酵所產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物，這與張靜等[34]的研究結(jié)果一致。說明在天然牧草青貯中添加丙酸可以有效改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。

3.3 丙酸濃度對天然牧草青貯微生物數(shù)量及有氧穩(wěn)定性的影響

青貯飼料中大腸桿菌與酵母菌數(shù)量影響著青貯飼料是否發(fā)生腐敗變質(zhì)，決定著青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)，各處理組有氧穩(wěn)定時長均高于對照組，Wilkins[39]曾提出青貯飼料中酵母菌數(shù)量大于5 lg cfu·g-1FW時，青貯飼料易發(fā)生腐敗變質(zhì)，本試驗研究發(fā)現(xiàn)添加不同濃度丙酸均可以顯著降低大腸桿菌與酵母菌數(shù)量，使青貯飼料發(fā)生有氧變質(zhì)的概率降低，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。這主要是因為添加丙酸可以使青貯飼料pH值快速下降，酸性環(huán)境可以抑制有害菌生長，阻止酵母菌代謝乳酸和WSC。Driehuis等[40]研究發(fā)現(xiàn)乙酸與丙酸具有相同作用，也是一種抑制有氧暴露期間青貯飼料酵母菌和霉菌生長有效的物質(zhì)，能夠有效地抑制青貯飼料腐敗變質(zhì)。本試驗中天然牧草青貯發(fā)酵60 d后不同丙酸濃度處理組均具有較高的乙酸含量，可以抑制酵母菌和霉菌的生長，因而獲得了較高的有氧穩(wěn)定性。青貯原料中附著的乳酸菌含量是決定青貯能否成功的關(guān)鍵，青貯原料乳酸菌附著量越大，青貯越容易成功。一般認(rèn)為青貯原料中乳酸菌附著含量大于5 lg cfu·g-1FW時，青貯可以具有較好的發(fā)酵效果[41]，而本研究中天然牧草青貯原料中乳酸菌附著含量較低，僅為0.54 lg cfu·g-1FW，但在青貯后由于丙酸抑制了不良微生物的生長，創(chuàng)造了利于乳酸菌的生存條件，使乳酸菌迅速繁殖，提高乳酸菌含量，促進青貯發(fā)酵[42]，提高天然牧草青貯發(fā)酵效果。同時各處理中均未檢測到霉菌，說明各處理均具有較好的發(fā)酵效果。

4 結(jié)論

本試驗研究表明，丙酸添加量為2 mL·kg-1，4 mL·kg-1，6 mL·kg-1均能夠不同程度的提高天然牧草青貯品質(zhì)，增加有氧穩(wěn)定性，減少不良微生物的產(chǎn)生。綜合考慮，在實際生產(chǎn)過程中丙酸添加量為2 mL·kg-1即可。