HPV E6/E7 mRNA與DNA檢測法在子宮頸癌前病變篩查中的對比分析

吳賽青，程 平，胡麗娟，沈玉蓮，張子悅，胡向陽

子宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，發病率較高[1]，持續感染人乳頭瘤病毒(human papillonma virus,HPV)是子宮頸癌發病的高危因素，尤其是高危型HPV[2]。近年，因多樣化檢查手段的聯合運用，子宮頸癌發病率有所下降。有研究表明[3]，HPV DNA敏感度優于液基細胞學(thinprep cytologic test,TCT)篩查，HPV的PCR檢測因其靈敏度高、特異性強，常用于HPV感染的早期篩查和分型檢測，但因HPV感染存在一過性感染情況，檢測中也可能存在假陽性，而導致轉診陰道鏡過度治療等問題。HPV E6/E7 mRNA作為HPV轉錄活性的重要標志，是子宮頸癌及癌前病變風險評估的關鍵指標之一。目前，關于HPV E6/E7 mRNA聯合TCT篩查手段的相關報道較少。本文通過HPV中E6/E7 mRNA與DNA法分別聯合TCT進行檢測，并在子宮頸癌前病變中進行對比分析，旨在協助臨床醫師選擇合理的子宮頸癌前篩查方法。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年1月～2021年12月安徽中醫藥大學第一附屬醫院TCT聯合HPV DNA分型篩查后，轉診陰道鏡下活檢的81例已婚女性患者。患者年齡19～79歲，平均49.5歲。納入標準：(1)患者均有性生活史；(2)TCT檢查陽性或HPV DNA分型檢測陽性或兩者聯合篩查陽性；(3)患者均轉診進行陰道鏡活檢。排除標準：(1)以往有子宮頸癌病史；(2)曾有子宮手術史或放療史；(3)妊娠期、哺乳期、近期有激素使用史；(4)陰道鏡檢測前行抗病毒治療或藥物治療。對每例細胞學標本再行HPV E6/E7 mRNA檢測。本實驗經我院醫學倫理會批準，患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1液基細胞學檢測 患者檢查前3天應避免陰道沖洗及性生活，避開經期，用棉球輕輕擦拭黏液，選用專用子宮頸采樣刷進行取樣，標本送檢病理科，制片。根據2018年修訂的子宮頸細胞學診斷系統(the bethesda system,TBS)進行相關閱片判讀，設備和試劑均購自廣州安必平公司。

1.2.2HPV DNA基因分型檢測 取樣方法同子宮頸液基細胞學檢查，采用HPV反向點雜交法檢測進行HPV基因分型提取PCR擴增后，可檢測28種HPV亞型。結果判讀：HPV檢測膜條上，質控點PC、CC點均要顯色(圖1)。本試劑盒可檢測15種高危型病毒亞型(16、18、31、33等)，3種疑似高危型病毒亞型(26、53、66)，10種低危型病毒亞型(6、11、40等)；試劑均購自廣州安必平公司。

圖1 HPV DNA 16、18型陽性

1.2.3陰道鏡子宮頸活檢病理學檢查 陰道鏡檢查前患者應選擇非經期時間，并于檢查前3天避免性生活，禁止陰道沖洗。采用電子陰道鏡檢查，擴陰并充分暴露子宮頸后，將探頭置入受檢者陰道內，通過醋酸白實驗，對呈現出白色病變、點狀血管、碘不著色等可疑部位行多點活檢，送病理檢查，制成薄切片，染色，鏡檢。根據WHO(2014)女性生殖器官腫瘤標準進行分類[4]：炎癥、子宮頸低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)、子宮頸高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA檢測 子宮頸脫落細胞，取樣方法與子宮頸液基細胞學檢查相同，待檢測；取子宮頸脫落細胞樣本1 mL，離心后去除上清。加入1 mL DEPC水，充分震蕩混勻，再次離心去除上清，備用。將提取好的核酸5 μL對應加入反應體系，利用熒光PCR儀自動上機進行擴增反應，設定陰、陽性質控品，利用Taqman探針并進行Blast比對，記錄樣本Ct值，判讀結果：樣本在相應的通道內有對數擴增曲線且Ct≤26，標記為“+”；無對數擴增曲線或Ct值>26時，標記為“-”。可檢測15種高危型病毒亞型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82)，3種疑似高危型病毒亞型(26、53、66)，6種低危型病毒亞型(6、11、40等)，試劑均購自廣州安必平公司。

2 結果

2.1 子宮頸癌前病變中HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA的檢測81例已婚女性陰道鏡下子宮頸活檢結果顯示，炎癥20例(圖2)，LSIL 21例(圖3)，HSIL 40例(圖4)。其中，經HPV E6/E7 mRNA檢測：炎癥組3例陽性(15%)，LSIL組17例陽性(80.95%)，HSIL組39例陽性(97.5%)；經HPV DNA檢測顯示：炎癥組15例陽性(75%)，LSIL組15例陽性(71.43%)，HSIL組32例陽性(80%)(表1)。統計結果顯示，兩種檢測方法陽性結果具有一致性，除炎癥組外，LSIL組和HSIL組HPV DNA陽性病例HPV E6/E7 mRNA檢測結果均陽性。

表1 Bethesda分類中兩種檢測方法陽性率對比分析[n(%)]

2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測子宮頸癌前病變中HPV的不同型別除炎癥組3例陽性外，HPV E6/E7 mRNA檢測LSIL與HSIL組的53例陽性患者高危型HPV 16、18型陽性分別為：10例(47.6%)、27例(67.50%)，其他型別陽性分別為：8例(38.1%)、14例(35.0%)(表2，圖5、6)。

表2 HPV E6/E7 mRNA檢測子宮頸癌前病變中HPV的不同型別[n(%)]

圖5 HPV E6/E7 mRNA16型陽性

2.3 炎癥組中HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA檢測陰道鏡轉診比較子宮頸活檢炎癥組中，20例HPV E6/E7 mRNA聯合TCT檢測僅3例(15.0%)患者行陰道鏡檢查，HPV DNA聯合TCT檢測顯示需15例(75.0%)患者行陰道鏡檢查。結果顯示：HPV E6/E7 mRNA聯合TCT檢測與HPV DNA聯合TCT檢測相比，其可以降低陰道鏡轉診例數，防止過度治療。

圖6 HPV E6/E7 mRNA16、18、52型陽性

3 討論

2018年全球癌癥統計報告顯示子宮頸癌發病率位居惡性腫瘤的第14位，位居女性癌癥的第4位，在發展中國家其發病率位居女性腫瘤的第2位[5-6]。子宮頸癌與HPV感染密切相關，合理的檢測方法有利于改善患者的治療與預后[7]。由于檢測方法多樣化，科學家已鑒定出200多種HPV型別，不同的型別存在致病的差異性，根據其與子宮頸癌的關系可將其分為高危型和低危型，尤其以高危型HPV持續感染最為顯著[8]。從子宮頸上皮內病變發展為子宮頸癌需要一個長期過程，子宮頸癌前病變臨床檢測方法也多樣化，單一檢查可能存在一定的漏診及過度治療，聯合幾種檢測方法篩查可提高診斷的敏感性，降低漏診率，防止HPV一過性感染引起過度的陰道鏡轉診治療。有研究顯示HPV E6/E7 mRNA檢測對HSIL檢測優于TCT檢測；HPV E6/E7 mRNA聯合TCT檢測更能降低HSIL的漏診率，具有重要的臨床意義[9]。

HPV屬于小型無包膜長雙鏈環狀DNA病毒，病毒編碼基因E6、E7在宿主細胞中的表達是子宮頸癌發生的關鍵因素。根據HPV基因組組成以及HPV E6/E7 mRNA致病蛋白惡性細胞轉化過程中作用模式，E6致癌蛋白通過其它相關蛋白能與宿主細胞p53蛋白特異性結合形成復合物，利用泛素降解系統促使p53蛋白快速降解，其效應等同于p53突變，阻止細胞所依賴凋亡途徑，而阻礙細胞的凋亡進程從而使細胞永生化[10]；E7致癌蛋白通過解離E2F和Rb復合物，使Rb通路失活，促使細胞永生，導致癌變[11]。此外，宿主上皮細胞惡變是由于HPV癌基因的轉錄產物E6/E7 mRNA表達。有研究報道，惡性腫瘤的浸潤轉移與上皮-間質轉化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)可通過致癌基因E6和E7激活表達，使得細胞趨于EMT變化，從而進一步增強惡性細胞的侵襲力[12-13]。

子宮頸活檢是診斷子宮頸癌及癌前病變的金標準，也是聯合癌前篩查的最后步驟，但檢查費用高且有創傷。臨床在子宮頸防癌篩查前，一般采用其他無創手段進行子宮頸癌前病變的初篩。其中TCT檢查是最常用的子宮頸癌及癌前病變的篩查手段，但由于受取材技術及診斷醫師的主觀影響，也存在漏診可能。使用TCT聯合HPV檢測篩查子宮頸癌，可降低單項檢查的誤、漏診率[14]。HPV分為高危、低危型，有研究分析了高危型HPV分型檢測對子宮頸癌及癌前病變篩查的意義。也有報道顯示子宮頸癌以高危型HPV 16和18型為主，少數患者感染其他高危型HPV[15]。余偉等[16]采用HPV E6/E7 mRNA聯合TCT對子宮頸癌及癌前病變進行篩查，效果優于HPV DNA聯合TCT。HPV DNA與子宮頸癌的發生過程關系較為緊密，但也存在一過性感染情況；HPV E6/E7 mRNA可能與子宮頸癌的發展相關性更高[17]。HPV E6/E7標志物能顯示患者子宮頸癌基因情況，且E6/E7蛋白共同表達能發揮協同作用，HPV E6/E7 mRNA是評估子宮頸癌風險的有效指標[18]。本實驗收集81例轉診陰道鏡活檢的組織標本，以子宮頸活檢結果為金標準，對比分析HPV E6/E7 mRNA聯合TCT檢測及HPV DNA聯合TCT檢測，結果顯示：高危型陽性，尤其是HPV 16、18型高危型感染陽性及長期感染，更易引起子宮頸癌及癌前病變。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA在LSIL診斷中無明顯差異，但在診斷HSIL時HPV E6/E7 mRNA的臨床價值更高；炎癥組中HPV E6/E7 mRNA聯合TCT檢測比HPV DNA聯合TCT檢測，更能降低陰道鏡轉診率，避免過度治療。

綜上所述，通過HPV E6/E7 mRNA與TCT聯合篩選與HPV DNA與TCT聯合篩選的對比，結果顯示：前者在HSIL中具有更高的應用價值，HPV E6/E7 mRNA是臨床潛在的診斷子宮頸癌生物學標志物，能為患者臨床診斷治療提供科學依據，防止HPV一過性感染而引起過度陰道鏡轉診。