液相色譜串聯四極桿線性離子阱質譜測定秸稈發酵飼料中米酵菌酸和毒黃素

索德成， 肖志明， 張 晶， 王 石， 馮玉超，3， 管 鑫，3， 李 陽， 樊 霞*

（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；2.福建省農產品質量安全檢驗檢測中心，福建福州 350003；3.黑龍江八一農墾大學，黑龍江大慶 163000）

椰毒假單胞菌是一種致死率很高的病原菌，此菌主要產生2種毒素：米酵菌酸（Bongkrekic acid）和毒黃素 （Toxoflavin）（田鳳麗等，2017；Buckle等，1990；Nugteren等，1957）。米酵菌酸可以與細胞中的線粒體ADP/ATP轉運體結合，阻止ADP的轉移，并且其對人、動物有毒性作用，可引起中毒性肝炎、中毒性腎病等，從而導致臟器損傷，動物中毒癥狀為萎頓、豎毛、平衡障礙，瀕死時有抽搐等現象（劉瑩等，2003）。毒黃素可以直接作用與細胞內的電子傳遞鏈，影響呼吸作用并產生大量的有毒的過氧化氫分子，對人、動物皆有毒性作用，主要為急性中毒，中毒后會出現呼吸急而深，全身震顫、抽搐，血尿或血色素尿等現象 （翁晨輝等，2017；Hellendoorn等，1961），與米酵菌酸共同作用，可以引起細胞死亡。劉秀梅等（1991）從干玉米葉中分離到9株椰毒假單胞菌酵米面亞種，并在其產毒培養物中檢出米酵菌酸；趙晉等（1997）也從發酵玉米中檢出米酵菌酸。秸稈發酵飼料是以玉米、甜高粱等為原料，經微生物發酵加工而成的飼料，已廣泛應用于反芻動物的飼養中，在單胃動物飼糧中也有一定的應用（韓明鵬等，2010；楊永明等，2002）。因此對發酵飼料中米酵菌酸和黃毒素的風險進行監測和評估具有重要意義。

目前，國內外關于米酵菌酸和黃毒素檢測方法大多集中于食品領域，包括生物傳感測定法、薄層色譜法、高效液相色譜法及高效液相色譜質譜法等。生物傳感器法利用其β-半乳糖苷酶活性測定毒黃素濃度，抗干擾能力較弱，需要較好的凈化手段（劉倩妤等，2020；Choi等，2013）。薄層色譜法的前處理較為復雜、有機試劑的消耗量大、基質干擾多、結果回收率低，不適用于批量樣品的檢測分析（Nugteren等，1957），國家標準GB 5009.189修訂時刪除了薄層色譜法。液相色譜法因飼料樣品基質復雜所致，對前處理過程的要求較高，檢測限也較高，無法滿足痕量分析要求（沈瀟冰等，2018；李紅艷等，2016；Voragen等，1982）。近年來，應用LC-MS/MS進行米酵菌酸和毒黃素檢測的研究日趨增多，配合簡單的前處理過程即可滿足痕量檢測要求（王俊虎等，2020；Liang等，2021；曾令浩等，2019；周鵬，2015），但缺乏秸稈發酵飼料中米酵菌酸和毒黃素的同步分析方法。為此，本研究利用多重吸附前處理技術，配合液相色譜串聯四極桿線性離子阱質譜，旨在建立同步檢測秸稈發酵飼料中米酵菌酸和毒黃素的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑AB SCIEX Triple Quad 6500+型液相色譜串聯四極桿線性離子阱質譜儀（美國AB SCIEX公司）：配有電噴霧電離源（ESI源），米酵菌酸標準品（純度＞98%）：購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；黃毒素標準品（純度＞98%）：購自美國Target Molecule公司；乙腈和甲醇：色譜純，購自德國Fisher ChenAlert Guide公司；其他試劑：均為分析純，購自北京化學試劑公司；試驗用水：經Milli-Q純化制備的一級水（＞18.2 MΩ）。0.22 μm尼龍濾膜：購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 實驗材料 前處理吸附材料：HLB填料購自深圳逗點科技有限公司；Carb填料、Al-N填料、C18填料購自天津博納艾杰爾科技公司；PSA填料、Carb填料、SCX填料、SAX填料購自美國安捷倫科技有限公司；納米碳（Nano Carb）（粒徑10～20 nm）購自先鋒納米有限公司。具體材料類型等相關信息參見表1。

表1 吸附材料名稱與類型

多重吸附前處理吸附材料的制備：稱取2 g HLB填料和3 g Al-N填料于50 mL三角瓶中，混合均勻，備用。

實驗用秸稈發酵飼料樣品由國家飼料質量檢驗檢測中心（北京）提供，采集于使用秸稈發酵飼料的養殖場或生產企業。

1.3 樣品前處理 準確稱取2 g秸稈發酵飼料樣品（精確至0.01 g），加入20 mL 1%甲酸溶液+乙腈溶液（15+85），振蕩提取30 min，于10000 r/min條件下離心5 min，取上清液備用。

移取3 mL上清液，置于10 mL離心管中，加入100 mg多重吸附前處理吸附材料和500 mg無水硫酸鎂，漩渦混合30 s，于10000 r/min條件下離心2 min；將上清液轉移至10 mL離心管中，在40℃溫度下用氮氣吹至近干，加入0.5 mL乙腈+0.1%甲酸水溶液（10+90），漩渦混合30 s，過0.22 μm濾膜，上液相色譜串聯四極桿線性離子阱質譜測定。

1.4 色譜和質譜條件 色譜柱：Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）；柱溫：35℃；進樣量：10 μL；流動相流速：0.3 mL/min，梯度淋洗。流動相組成及洗脫梯度條件見表2。質譜采用電噴霧電離源（ESI）正負離子切換模式進行分段采集，0～3 min為正離子檢測模式，用于測定毒黃素；3～5 min采用負離子模式，用于測定米酵菌酸。噴霧電壓為4.5 kV；毛細管溫度為420℃；脫溶劑氣和碰撞氣均為高純氮氣，氣量分別為50 arb和30 arb。具體參數見表3。

表2 流動相梯度條件

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜條件的優化 用微量注射泵直接將米酵菌酸和毒黃素標準溶液（50 ng/mL）注入質譜儀，分別在正負離子模式下進行全掃描，以確定米酵菌酸和毒黃素的分子離子峰，米酵菌酸在負離子模式下有很高的響應值，其主要的分子離子峰為[M-H]－；毒黃素在正離子模式下響應值高，其主要的分子離子峰為[M+H]+。分別在各自的檢測模式下對其子離子進行全掃描，獲得二級質譜響應較強的子離子；然后進行優化，獲得去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）等相關參數，具體參數參見表3。

表3 米酵菌酸和毒黃素的質譜條件

目前，采取液相色譜檢測米酵菌酸和毒黃素的報道中多數采用以甲酸或乙酸水溶液為水相，以甲醇或乙腈為有機相的基本流動相條件。為此，本實驗參考上述流動相條件進行研究，結果表明，使用0.1%甲酸乙腈溶液作為流動相進行梯度洗脫，待測物質的色譜峰型和出峰穩定性較好，可以在6 min內有效分離2種目標化合物，節省了溶劑消耗，降低了分析成本和廢液產生。具體色譜圖見圖1。

圖1 米酵菌酸和毒黃素定量離子色譜圖

2.2 提取條件選擇 米酵菌酸和黃毒素的結構和性質差異較大。米酵菌酸是一種脂類毒素，易溶于有機溶劑中（方力等，2022）；毒黃素屬水溶性黃色素，不溶于石油醚、乙醚和二甲苯等有機溶劑中，但在甲醇、乙腈、氯仿、二甲基亞砜具有一定的溶解性。本實驗以秸稈發酵飼料為基質，考察了甲醇、乙腈、氯仿、二甲基亞砜、乙腈+甲酸溶液、乙腈+氨水溶液、乙腈+水溶液的提取效果。實驗時，稱取空白秸稈發酵飼料2 g，加入0.1 mL 1 μg/mL米酵菌酸與毒黃素標準溶液，加入20 mL不同類型的提取溶劑，漩渦振蕩提取30 min，在10000 r/min條件下離心5 min。取上清液過膜，上機檢測，每組實驗重復3次，計算回收率。分析結果如圖2所示。

圖2 不同溶液提取秸稈發酵飼料中米酵菌酸和黃毒素的效果對比

由圖2可知，甲醇有較好的提取能力，但也同時存在會萃取出多種其他成分而產生基質干擾的情況，不利于下一步凈化。二甲基亞砜提取時，提取液中含有大量蛋白和色素等雜質，影響定性與定量的效果；同時污染色譜柱，結果回收率較低。氯仿對毒黃素的提取效果較好，但是對米酵菌酸的提取效果較差。乙腈對兩種毒素均有較好的提取能力，因此選用乙腈作為有機萃取劑。為了進一步提高回收率，適量加入甲酸或氨水溶液，加入一定比例的水溶液后，毒黃素和米酵菌酸的回收率可以達到80%以上，原因可能是毒黃素的水溶解性強、水能有效提取秸稈發酵飼料中毒黃素，同時水能提高有機溶劑對米酵菌酸的滲透性，從而提高對米酵菌酸提取效率（方力等，2022）。采用乙腈+氨水提取時，目標物米酵菌酸與溶劑中的NH4+離子結合，導致回收率降低。采用乙腈+甲酸溶液作為提取劑時，毒黃素和米酵菌酸的回收率均可以達到80%以上。綜合以上分析，本研究最終選擇20 mL 1%甲酸溶液+乙腈（15+85）溶液作為提取溶液。

2.3 多重機制雜質吸附凈化的條件選擇 目前常用固相萃取柱和QuEChERS凈化米酵菌酸或毒黃素（Liang，2021；周鵬，2015），然而由于毒黃素分子質量小，研究過程中發現無法使用固相萃取柱進行有效富集和凈化，同時常用的QuECh-ERS材料如PSA、C18對在秸稈發酵飼料樣品的凈化效果一般，需要找到或研發新的填料用于米酵菌酸或毒黃素的凈化去除雜質。為此，本研究中選擇10種常見的不同凈化填料，探索對秸稈發酵飼料中米酵菌酸或毒黃素的凈化回收效果。具體實驗步驟如下：稱取空白秸稈發酵飼料20 g，加入200 mL 1%甲酸溶液+乙腈溶液（15+85），振蕩提取30 min，在10000 r/min條件下離心5 min，將上清液轉移至試劑瓶中備用。分別吸取3 mL提取液，加入0.3 mL 1 μg/mL米酵菌酸與毒黃素標準溶液，再分別加入100 mg各種吸附材料，漩渦混合30 s，在搖床上振蕩15 min，10000 r/min條件下離心5 min，取上清液過膜，上機檢測；同時吸取3 mL提取液，不加入吸附材料作為空白參考。每組實驗重復3次，用測定值與空白參考比值計算回收率，并以此比較吸附效果，結果見圖3。

圖3 不同吸附劑對米酵菌酸與毒黃素吸附能力比較

從圖3可以看出，吸附材料能吸附部分干擾物質，降低了樣品的基質效應，使處理后回收率高于空白提取液；但FL吸附材料對米酵菌酸有明顯的富集作用（回收率＞100%），但對毒黃素吸附率不到50%，不宜作為富集材料使用；而使用HLB填料和Al-N填料進行吸附后，檢測結果具有較好的回收率。其中，HLB填料是親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，親脂性的二乙烯基苯結構保留非極性化合物，親水性的N-乙烯基吡咯烷酮結構保留極性化合物，使得該填料具有良好的吸附雜質性能；Al-N填料為中性氧化鋁，主要作用機理為物理吸附，可去除部分重金屬、部分色素和酯類物質。綜合實驗結果和理論分析，選擇HLB和Al-N作為多重機制雜質吸附的組成材料，通過混合使用，可以有效的去除秸稈發酵飼料提取液中的各種雜質干擾，達到更好的凈化效果。因此，本研究最終采用多重機制雜質吸附技術（MIA）來凈化樣品。將各種材料按不同比例添加進行凈化研究，從基質凈化效果來看，HLB和Al-N的比例為1:1，能有效地吸附雜質，從而降低基質效應。當加入吸附劑吸附凈化后，在有效地除去基質中的干擾物對待測物色譜峰的影響的同時，還可以減少雜質對儀器和色譜柱的損害。

在此基礎上，本研究考察了吸附材料的不同使用量對樣品凈化效果的影響，比較了不同固體吸附劑添加量（10、20、50、100、200、500 mg）對秸稈發酵飼料提取液中雜質凈化效果的影響。結果表明，當固體吸附材料加入量達100 mg時，溶液色澤明顯變淺；但繼續加大吸附劑的用量，對秸稈發酵飼料樣品雜質的凈化效果無明顯改善。因此，將吸附材料加入量設定為100 mg。

2.4 基質標準曲線線性方程和檢出限，定量限不同秸稈發酵飼料樣品的組成比較復雜，使用液相色譜-串聯質譜進行檢測時基質干擾非常明顯，對標準溶液進行標準曲線的線性關系進行研究時，需針對特定基質進行。取空白秸稈發酵飼料樣品進行前處理，以此基質提取液作稀釋液配制混合標準溶液，與直接用定容液配制的標準溶液對比，結果毒黃素呈現基質抑制效應，米酵菌酸無明顯基質效應。為消除基質效應，本實驗繪制基質校正標準曲線來進行定量。取空白樣品進行前處理后，配制米酵菌酸與毒黃素濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的基質混合標準溶液，以定量離子色譜峰面積與基質混合標準溶液的濃度作標準曲線，計算結果見表4。可見基質混合標準溶液在1.0～100 μg/L內線性關系良好。設定定量離子色譜峰的3倍信噪比（S/N）為檢出限（LOD），10倍S/N為定量限（LOQ），得出米酵菌酸與毒黃素的LOD和LOQ。

表4 米酵菌酸與毒黃素線性方程、LOQ和LOQ

2.5 回收率和精密度 稱取2 g空白樣品，添加適量米酵菌酸與毒黃素標準溶液，制備米酵菌酸與毒黃素添加水平分別為5、100、1000 μg/kg的秸稈發酵飼料樣品，每個添加水平制備18份樣品，按本研究建立的方法，每天測定6份，連續測定3 d，計算其日內和日間回收率，及其相對標準偏差（RSD），結果見表5。

表5 回收率與精密度實驗結果

結果顯示，本方法回收率為82.8%～102.0%，相對標準偏差小于15.0%，滿足飼料分析方法的要求。

2.6 實際樣品檢測 按上述方法對50份秸稈發酵飼料樣品進行檢測，其中6份樣品中檢出米酵菌酸或毒黃素，其中米酵菌酸含量為3.5～56.7 μg/kg，毒黃素含量為5.3～14.6 μg/kg，其含量差異比較明顯，部分秸稈發酵飼料樣品中2種毒素同時有檢出。

3 結論

本研究建立了利用多重吸附技術結合液相色譜串聯四極桿線性離子阱質譜（LC-MS/MSQTRAP）測定秸稈發酵飼料中米酵菌酸和毒黃素含量的方法。該方法前處理簡單，線性良好，回收率和相對標準偏差、方法檢出限、方法定量限均能滿足秸稈發酵飼料中毒素含量檢測的要求。采用建立的方法對實際樣品進行檢測，部分秸稈發酵飼料中檢出米酵菌酸和毒黃素，結果表明，秸稈發酵飼料中米酵菌酸和毒黃素存在安全風險的情況，應盡快制定相應的檢測標準和限量要求，防止因動物飼料傳遞造成的畜產品質量安全。