NLRP3炎性小體在脂多糖誘導的高糖心肌細胞缺氧復氧損傷中的作用及機制

李 璐 邱 珍 張 藝 田 浩 夏中元

糖尿病患者心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)的發生率、梗死心肌的面積及充血性心力衰竭的發生率均顯著高于非糖尿病患者。MIRI合并膿毒癥患者的心肌常同時面臨供氧不足和氧利用受損的雙重打擊。膿毒癥條件下，病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)和損傷相關分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)是缺血再灌注期間心肌損傷加重的重要機制，而炎性反應和氧化應激也與膿毒癥誘導的心肌損傷密切相關。

NLRP3炎性小體是一種細胞內多蛋白復合物，由Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor protein-3, NLRP3)、含有CARD的凋亡相關斑點樣蛋白(ASC) 和半胱天冬酶-1前體(pro-caspase-1)組成。NLRP3炎性小體誘導pro-caspase-1進行自我切割和活化，刺激促炎性細胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放，引起炎性細胞積聚，放大炎性反應，誘導程序性細胞死亡。外源性刺激脂多糖(LPS)可通過誘導活性氧(ROS)產生、活化NLRP3炎性小體介導炎性反應和細胞焦亡的發生。糖尿病狀態下，高血糖引起的代謝紊亂、氧化應激增加以及線粒體功能障礙導致ROS產生增加，加重糖尿病心肌損傷。筆者前期研究表明，ROS誘導NLRP3炎性小體激活介導的caspase-1依賴性細胞焦亡在糖尿病大鼠MIRI中起重要作用。

本研究擬探討NLRP3炎性小體的激活對LPS誘導的H9C2心肌細胞高糖H/R損傷的作用及其潛在機制。

材料與方法

1.細胞與試劑：H9C2大鼠心肌細胞系購自中國科學院細胞庫(上海);10%胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;乳酸脫氫酶 (LDH)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 和cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒購自中國南京建成生物科技有限公司；線粒體ROS檢測采用MitoTracker Red CMXRos試劑盒購自上海翔圣生物科技有限公司；Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa Bio公司；NF-κB抗體購自美國Cell Signaling Technology (CST) 公司；ASC、caspase-1抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology(Santa)公司;IL-1β抗體購自英國Abcam公司；NLRP3抗體購自美國Novus Biologicals公司；熒光二抗(山羊抗兔)購自美國CST公司。

2. H9C2心肌細胞培養與分組：H9C2心肌細胞用含10%的胎牛血清、1%雙抗的DMEM于37℃、5%CO的細胞培養箱中進行培養。每兩天更換培養基，當細胞密度達到80%～90%時，用0.05%胰蛋白酶消化細胞，將細胞接種在6孔板或96孔板中，置于細胞培養箱中培養。實驗前12h，更換為無血清培養基,對細胞進行饑餓處理。細胞隨機分為4組，即高糖(H)組(葡萄糖終濃度為30mmol/L的高糖DMEM培養基培養48h)、高糖+缺氧/復氧(H+H/R)組(高糖DMEM培養基培養48h后，于含95%N、5%CO和1%O三氣培養箱中缺氧6h，然后于正常培養箱復氧4h)、高糖+LPS+缺氧/復氧(H+LPS+H/R)組(高糖培養基培養24h，再加入終濃度為1μg/ml的LPS繼續培養24h，后進行缺氧6h復氧4h操作)和高糖+LPS+BAY11-7082干預+缺氧/復氧(H+LPS+BAY+H/R)組(施加LPS處理2h后，給予5μmol/L的BAY11-7082)。

3.心肌細胞活力檢測：采用CCK-8測定試劑盒進行細胞活力測定。待細胞H/R刺激結束后，調整96孔板中細胞個數約為1×10個/毫升，每孔100μl培養基中加入10μl CCK-8試劑，于37℃培養箱避光孵育3h，酶標儀下測定450nm處吸光度()值。

4.細胞培養基中乳酸脫氫酶(LDH)水平檢測：采用LDH測定試劑盒檢測細胞培養基上清液中的LDH活性以評估細胞損傷，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，混合試劑后，在室溫下放置5min，酶標儀下測定450nm處吸光度值。

5.線粒體ROS檢測：采用Mito Tracker Red CMXRos試劑盒檢測線粒體ROS產生，步驟如下：細胞刺激結束后，吸去舊培養基，用PBS洗2遍，加入染色工作液，于37℃培養箱避光孵育30min；然后棄掉染色工作液，PBS洗3遍，加入新鮮培養基，于熒光倒置顯微鏡下進行觀察和拍攝。

6.心肌細胞NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA 表達測定：實時熒光定量PCR檢測LRP3、ASC、caspase-1和IL-1β mRNA表達。使用Trizol試劑從細胞中提取總RNA，然后用反轉錄試劑盒將1μg的總RNA反轉錄成cDNA。使用NLRP3、ASC和caspase-1特異性引物通過定量RT-PCR儀進行總體積20μl反應體系進行擴增。讀取Ct值，用2表示目的基因mRNA相對于對照組的表達量。

7.Western blot法檢測心肌細胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白水平：使用含有蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑混合物的預冷蛋白裂解液(RIPA)裂解心肌細胞，4℃下12000r/min離心15min，取上清保存。用BCA法測定蛋白濃度，加5×上樣緩沖液混勻煮沸10min。用濃度為10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，并濕轉于PVDF膜上。將PVDF膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉1h，分別加入NF-κB(1∶1000)、NLRP3(1∶200)、ASC(1∶200)、caspase-1(1∶200)，IL-1β(1∶1000)的一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10min，用熒光二抗(1∶15000)室溫孵育1h，TBST洗滌3次，每次10min。采用Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀檢測蛋白條帶，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

結 果

1.各組心肌細胞活力、上清LDH水平和線粒體ROS產生水平比較：與H組比較，H+H/R組細胞活性降低，LDH水平升高，線粒體ROS產生增加(<0.05)；LPS處理后，H+LPS+H/R組與H+H/R組比較，細胞活性進一步降低，LDH水平進一步升高，線粒體ROS水平進一步增加(<0.05)；使用BAY11-7082干預后，H+LPS+BAY+H/R組與H+LPS+H/R組比較，細胞活性增加，LDH水平下降，線粒體ROS產生減少(<0.05，圖1)。

2.各組心肌細胞NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA 表達的比較：與H組比較，H+H/R組細胞NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA 表達上調(<0.05)；LPS處理后，H+LPS+H/R組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β mRNA表達較H+H/R組上調(<0.05)。BAY11-7082干預后，與H+LPS+H/R組比較，H+LPS+BAY+H/R組細胞ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA表達下調(<0.05)，NLRP3 mRNA表達差異無統計學意義，詳見表1。

3.各組心肌細胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達比較：與H組比較，H+H/R組心肌細胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達上調(<0.05)；LPS處理后，H+LPS+H/R組心肌細胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達較H+H/R組顯著上調(<0.05)；BAY11-7082干預后，與H+LPS+H/R組比較，H+LPS+BAY+H/R組細胞NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達明顯下調(<0.05)，詳見圖2、表2。

討 論

與非糖尿病患者比較，糖尿病患者罹患心血管事件的風險更高，預后更差。缺血性心臟病患者在膿毒癥期間氧耗的增加可以導致更加嚴重的急性冠狀動脈綜合征。LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的抗原成分，也是Toll樣受體4激活劑，可以促進各種炎性細胞因子的上調，而這些細胞因子在炎性反應的誘導和調節中起關鍵作用。雖然相關研究表明，LPS處理可加重MIRI和H9C2心肌細胞損傷，但其與糖尿病狀態下的MIRI研究鮮有報道。因此，本研究中使用1μg/ml的LPS刺激H9C2心肌細胞，結果表明LPS可以顯著降低細胞活力，增加LDH水平，進而加重高糖下H/R誘導的H9C2細胞損傷。

NLRP3炎性小體作為炎性反應的介質，可以識別LPS、ATP、葡萄糖、ROS等PAMP和DAMP的刺激。NLRP3炎性小體的活化機制涉及NLRP3寡聚化、ASC募集和caspase-1活化，活化的caspase-1切割白IL-1β和IL-18前體，將其激活成為有活性的IL-1β和IL-18,并通過GSDMD細胞膜孔道將其釋放至細胞外，招募更多炎性細胞，擴大炎性反應,引發下游促炎信號通路的級聯反應，最終可使細胞發生自噬或焦亡等程序性死亡。近年來研究表明，抑制NLRP3介導的焦亡作用，可以減輕藥物誘導或心肌梗死后的心肌損傷。

ROS可介導細胞自噬、焦亡和炎性反應的發生。據報道，LPS誘導心肌細胞的損傷主要依賴過量生成的ROS。此外，糖尿病的高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗狀態增加了氧化應激水平，導致糖尿病心肌中各種細胞因子的過度產生。因此，高血糖增加ROS的產生，引發caspase-1依賴性的細胞焦亡可能是糖尿病性心肌病的重要病理機制之一。筆者前期研究發現，NLRP3激活誘導的caspase-1依賴性細胞焦亡導致糖尿病MIRI的發生與發展。本研究中筆者用LPS作為PAMP信號刺激H9C2心肌細胞，結果表明，經過LPS處理的H9C2心肌細胞在高糖H/R刺激下，心肌細胞活性明顯降低，LDH釋放水平、線粒體ROS產生明顯增加，NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達明顯上調， H9C2心肌細胞損傷明顯加重。因此，筆者推測LPS作為PAMP因子可通過增加線粒體ROS產生激活NLRP3炎性小體，誘導caspase-1和IL-1β炎性反應信號轉導途徑，進而加重高糖H/R誘導的H9C2細胞損傷。

NF-κB的持續激活在調節細胞增殖/凋亡和炎性反應期間炎性細胞因子水平增加中具有重要作用，也是NLRP3的上游激活因子。BAY11-7082是NF-κB的選擇性抑制劑，它不可逆地抑制NF-κB磷酸化并直接抑制ATP酶活性，從而使ASC寡聚化并激活caspase-1，從而減少NLRP3炎性小體激活。BAY11-7082是一種有效的炎性小體抑制劑，可通過抑制NF-κB活性進而抑制NLRP3炎性小體活性，明顯減輕組織炎性損傷。因此，筆者選擇BAY-11-7082作為NLRP3炎性小體抑制劑，探究NLRP3炎性小體在LPS加重H9C2心肌細胞高糖H/R損傷的作用機制。筆者發現當使用炎性體抑制劑BAY11-7082后，心肌細胞活性明顯增加，LDH水平和線粒體ROS的產生明顯減少，并且NF-κB、NLPR3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表達也明顯下調。以上結果表明，BAY11-7082作為炎性小體抑制劑可以抑制NLRP3炎性小體活化，進而減輕LPS誘導的H9C2心肌細胞高糖H/R損傷。

綜上所述，本研究結果表明，LPS通過增加線粒體ROS 產生，激活NLRP3炎性小體介導的caspase-1信號途徑，加重高糖H/R誘導的H9C2心肌細胞損傷。同時筆者還發現，BAY11-7082炎性體抑制劑可通過抑制NLRP3炎性小體激活來減輕LPS誘導的H9C2細胞高糖H/R損傷。因此，NLRP3炎性小體可能是減輕膿毒癥期間心肌I/R損傷的新的治療靶點。然而，本研究為細胞實驗，存在著一定的局限性，還有待于進一步開展臨床實驗驗證。