淫羊藿苷對人牙囊干細胞旁分泌作用的影響

鄭曉雪 王乙行 陶天翼 韓 冰

牙囊干細胞(dental follicle stem cell，DFSC)來自間充質組織，是一種牙源性干細胞，可從第三磨牙或多生牙牙囊中獲取。與其他間充質干細胞類似，DFSC具有分泌多種生物活性因子的旁分泌功能，這些因子已被報道可以調節免疫、促進細胞增殖、遷移及血管生成等。收集間充質干細胞的培養上清，這些生物活性因子存在其中，稱為條件培養基(conditioned medium，CM)，可用于基于干細胞分泌細胞因子的無細胞療法，具有廣泛的應用價值。多項研究表明，多種牙源性干細胞CM可以促進細胞的增殖、遷移及成骨分化。來源于多生牙的DFSC-CM能否在骨再生中發揮作用尚不明確。淫羊藿苷(icariin, ICA)是淫羊藿中提取的有效單體。研究發現，ICA類似于雌激素，可以刺激骨形成，抑制骨吸收。ICA能否調控DFSC旁分泌功能，發揮定向成骨的作用，尚少見報道。本研究通過ICA誘導多生牙來源的DFSC，制備了DFSC-CM,并通過檢測其對小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)增殖、遷移和成骨分化的影響，探究了ICA能否作為骨誘導因子，促進DFSC定向成骨的旁分泌作用。

材料與方法

1．主要試劑與儀器：高糖培養基、α-培養基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Ⅰ型膠原酶購自德國Sigma公司；淫羊藿苷購自北京索萊寶科技有限公司；人間充質干細胞成脂誘導培養基購自廣州賽業生物科技有限公司；β-甘油磷酸二鈉購自北京酷來博科技有限公司；地塞米松和維生素C均購自上海源葉生物科技有限公司；兔抗波形絲蛋白、角蛋白8抗體、DAB試劑盒均購自沈陽萬類生物有限公司；小鼠抗IGg、CD34、CD45、CD90、CD105抗體均購自美國Bio Legend公司；CCK-8、PCR試劑盒購自上海翌圣股份有限公司；酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；流式細胞儀購自美國BD公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

2．細胞分離、培養、鑒定：(1)MC3T3-E1(吉林省牙齒發育與頜骨重建與再生重點實驗室贈予)，用含10% FBS的高糖培養基于 37℃、5% CO細胞孵箱中培養。(2)提取原代DFSC：牙囊組織由吉林大學口腔醫院口腔頜面外科提供，術前檢測無傳染性疾病，并經患兒家長知情同意。拔除多生牙的同時刮出牙囊組織，冰盒運至實驗室。剪取約0.5cm×0.5cm大小，加入2.5g/L Ⅰ型膠原酶，消化30min，1000r/min離心5min。用含20% FBS、1%青霉素-鏈霉素混合液的α-培養基，放入細胞孵箱中培養。當細胞融合至90%，可1∶2傳代，第3～5代DFSC進行后續實驗。(3)細胞免疫化學：第4代DFSC，固定細胞20min，抗原修復后滴加1∶150 兔抗人波形絲蛋白抗體、1∶200兔抗人角蛋白8抗體，4℃孵育24h，次日用DAB試劑盒檢測細胞著色情況。(4)流式細胞術：第4代DFSC，細胞密度為1×10個/100微升，加入5μl抗體，分別為IGg、CD34、CD45、CD90、CD105，IGg為同型對照，冰上孵育30min, 避光，清洗2次，400μl PBS重懸細胞沉淀，換用流式管，上機檢測。(5)DFSC多向分化能力鑒定：第3代 DFSC，分別使用成骨誘導培養基(10mmol/L β-磷酸甘油二鈉，50μg/ml維生素C，0.01μmol/L地塞米松)、成脂誘導培養基培養細胞21天，分別行茜素紅、油紅染色，顯微鏡下觀察鈣結節、脂滴形成情況。

3.制備DFSC-CM:第3～5代DFSC，當細胞融合度達90%時，加入0、1和10μmol/L ICA,換用無血清的α-培養基培養24h，以1000×離心收集的培養上清5min，去沉淀后分裝，-80℃保存備用，與新鮮培養液1∶1 混合后用于后續實驗。實驗分為6組，分別為對照組(完全培養基)、0ICA-CM組(含0μmol/L ICA的DFSC-CM)、1ICA-CM組(含1μmol/L ICA的DFSC-CM)、10ICA-CM組(含10μmol/L ICA的DFSC-CM)、1ICA組(含1μmol/L ICA的完全培養基)、10ICA組(含10μmol/L ICA的完全培養基)。

4.細胞增殖檢測：按照2×10個/孔的細胞密度將MC3T3-E1接種在96孔板上，放入孵箱中培養，次日更換實驗組培養基。分別在培養的第1、3和5天時，取10μl的CCK-8檢測液加入100μl的培養基中，1.5h后酶標儀檢測450nm處的吸光度值。檢測結束后，棄液，結晶紫染色30min，顯微鏡下拍照。

5.細胞遷移檢測：(1)劃痕實驗：按20×10個/孔細胞密度將MC3T3-E1接種在預先底部水平畫線的6孔板上，細胞長滿后，用200μl槍頭垂直水平線劃開3處創口，PBS洗去劃脫細胞，更換無血清實驗組培養基，孵育24h后取出拍照，運用ImageJ軟件計算創口愈合面積。(2)Transwell小室實驗：選用24孔板小室，下室加入500μl實驗組培養基，MC3T3-E1按2×10個/200微升置于上室，12h后固定，結晶紫染色拍照，運用ImageJ軟件計算穿膜細胞數。

6.qRT-PCR檢測成骨基因表達水平：按照20×10個/孔細胞密度將MC3T3-E1接種在6孔板上，使用成骨誘導培養基(5μmol/L β-磷酸甘油鈉、50μg/ml維生素C、0.01μmol/L地塞米松)誘導7天，使用TRIeasy試劑分離總RNA，反轉錄合成為cDNA。在CFX96 RT-PCR檢測系統中使用 SYBR-Green實時PCR預混液擴增mRNA。表1為引物序列，使用比較2方法計算基因的相對表達水平，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)用作內部對照。

結 果

1.細胞分離及鑒定：本實驗取自多生牙患者的牙囊組織(圖1)，原代培養3天，可見DFSC從組織塊中爬出，呈長梭形(圖2A)，細胞集落呈旋渦狀(圖2D)。免疫細胞化學染色顯示，當DFSC細胞質無著色，上皮標志物角蛋白8表達陰性(圖2B)；DFSC細胞質呈棕黃色，間充質標志物波形絲蛋白表達陽性(圖2E)。成骨誘導后，DFSC內可見紅色鈣結節(圖2C)；成脂誘導后，DFSC可見到橙紅色脂滴(圖2F)。并且DFSC陽性表達間充質表面標志物CD90(88.14%)、CD105(84.20%),而陰性表達血液細胞表面標志物CD45(0.04%)、CD34(0.11%)，同型對照IGg(0.12%)。圖2、圖3結果表明，埋伏多生牙來源的DFSC符合間充質干細胞特征。

2.ICA誘導的DFSC-CM對MC3T3-E1增殖影響：如圖4A所示，1ICA組和10ICA組在第3天、第5天抑制了MC3T3-E1細胞活力(<0.01)，然而10ICA-CM組在培養5天后仍未見明顯毒性，0ICA-CM組與1ICA-CM組在第1天、3天、5天時細胞活力明顯高于對照組(分別為<0.05、<0.01、<0.001)。結晶紫染色顯示(圖4B)，0ICA-CM組與1ICA-CM組培養基在第3天、第5天時，細胞數量明顯多于對照組，1ICA組和10ICA組在第5天時細胞數量明顯減少。CCK-8實驗和結晶紫染色實驗結果相符合，因此表明，單純的DFSC-CM可以促進MC3T3-E1的增殖，DFSC-CM緩解了高濃度ICA對MC3T3-E1的毒性作用。

3.ICA誘導的DFSC-CM促進了MC3T3-E1遷移：如圖5中A、B示,MC3T3-E1在劃痕創口形成24h后，0ICA-CM組、1ICA-CM組、10ICA-CM組劃痕創口面積均較對照組小(對照組0.104±0.036；0ICA-CM組0.236±0.078,<0.05；1ICA-CM組0.200±0.069；10ICA-CM組0.234±0.087，<0.05)。Transwell結果表明，各組培養基培養MC3T3-E1 24h后，均有細胞遷移至下室，各CM組隨著ICA誘導劑量的增加，呈現劑量依賴方式(對照組194.000±29.816；0ICA-CM組170.333±62.164；1ICA-CM組404.333±79.651,<0.01；10ICA-CM組318.000±88.792)。1μmol/L ICA誘導的DFSC-CM細胞遷移數量顯著高于0μmol/L和10μmol/L ICA誘導的DFSC-CM(分別為<0.05、<0.01)。

4.ICA誘導的DFSC-CM上調了成骨標志基因的表達：與對照組比較，1ICA-CM組顯著上調了RUNX2的表達水平(圖6A，<0.001)，在圖6C中，0ICA-CM組和1ICA-CM組均上調了OCN表達水平(分別為<0.01、<0.001)，且與0ICA-CM組比較，1ICA-CM組升高的更多(<0.01)，圖6D和圖6C的結果相符，0ICA-CM組和1ICA-CM組均上調了OPN表達水平,差異均有統計學意義(均<0.001)。從qPCR結果可以看出，成骨誘導7天時，ICA誘導的DFSC-CM可以上調成骨標志基因的表達水平。

討 論

多生牙在牙齒發育過程中屬于數目異常。多生牙可以產生如恒牙遲萌，牙列不齊，頜骨囊腫等多種口腔頜面部發育的問題，本實驗應用多生牙患者的牙囊提取牙囊干細胞，無取材和倫理限制，且患者年齡小(4～10周歲)，細胞增殖活躍，多生牙來源的DFSC有可能成為間充質干細胞臨床應用的候選種子細胞。

研究表明，間充質干細胞可分泌多種生物活性因子，如血小板生長因子、血管內皮生長因子等，通過細胞外囊泡或者條件培養基的形式改變組織細胞所處的微環境，促進周圍干細胞的增殖、遷移及分化，從而發揮旁分泌作用。近年來研究發現，DFSC-CM可以促進牙周創口愈合，并且鼠DFSC-CM通過下調ERK1/2和NF-κB信號通路拯救發炎的大鼠牙髓再生。

研究表明，ICA常被作為骨誘導因子加載在支架或者納米纖維膜上，通過持續可控的方式釋放，在骨缺損的修復中得到了良好的修復效果。本研究利用ICA作為骨誘導因子，定向調節DFSC-CM的旁分泌作用，促進MC3T3-E1成骨分化。在增殖實驗中，1ICA-CM組與0ICA-CM組比較，ICA與DFSC-CM之間并未起到協同促進MC3T3-E1增殖的作用。據文獻報道，ICA促進鼠MSCs增殖濃度在0.01～0.10μmol/L。筆者前期實驗結果也表明，不同種屬對ICA的耐受程度不同，ICA(0.1～1.0μmol/L)可以促進人DFSC增殖，而ICA(5～20μmol/L)對人DFSC有抑制增殖并促進成骨作用。猜測原因可能是加入的ICA濃度是促進人DFSC成骨分化的最適濃度，DFSC-CM促進細胞增殖和促進細胞成骨可能存在不同的分子機制，因此ICA誘導DFSC旁分泌作用，釋放更多調節成骨分化的細胞因子，而釋放很少的促進增殖的細胞因子。

研究表明，缺損區創口的愈合、組織的生長、炎癥的調節等生理活動都離不開細胞的遷移與趨化。本研究驗證了DFSC-CM可以促進MC3T3-E1的橫向與縱向遷移，說明ICA可以上調DFSC旁分泌作用促進MC3T3-E1遷移。

ALP、OCN、OPN、COL-1等骨特異性基質蛋白、RUNX2、OSX等轉錄因子的表達可以調控ICA誘導的骨形成。本研究發現，0ICA-CM組可以上調OCN及OPN的表達，并且1ICA-CM組與其他組比較，RUNX2、OCN、OPN的表達具有顯著差異性。提示1μmol/L的ICA可能通過促進DFSC成骨的旁分泌作用，從而上調了MC3T3-E1的成骨相關基因的表達。

綜上所述，多生牙來源的DFSC可能成為候選的種子細胞，ICA誘導的DFSC-CM可以促進MC3T3-E1遷移和成骨分化。ICA可能通過調控DFSC旁分泌作用來發揮效果，具體的分子機制需要進一步的實驗研究來驗證。