miR-214/eNOS軸參與糖尿病大鼠腎損傷的機制研究

張芳菲 王奕雪 王 莉 劉 麗 劉東偉 王 鋒 汪年松 劉章鎖 梁如練

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是終末期腎衰竭的主要原因。調查顯示，我國2018年糖尿病的發生率高達12.4%，其中約40%的2型糖尿病和30%的1型糖尿病患者最終會發展成慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)。microRNA(miRNA)是高度保守的非編碼短RNA，主要通過與靶基因mRNA 3′UTR結合而降解靶mRNA或抑制翻譯參與轉錄后基因表達調控，在調節腎組織細胞損傷、壞死與間質纖維化等方面發揮著重要功能。miR-214是一種進化保守的miRNA，參與了急性腎損傷、CKD和DKD等多種腎臟疾病的病理生理過程。課題組前期研究發現，在高鹽誘導的Dahl鹽敏感大鼠中，miR-214表達顯著增加，抑制miR-214明顯改善了高鹽誘導的蛋白尿和高血壓。進一步研究表明，miR-214通過調控腎臟中的內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)參與鹽敏感性高血壓的發病機制。但是miR-214/eNOS軸在DKD進展中的作用機制尚不明確。本研究擬利用miR-214反義核苷酸(anti-miR-214)抑制miR-214表達，聯合應用N-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-argininemethylester，L-NAME)抑制eNOS活性，探討miR-214/eNOS軸在糖尿病大鼠腎損傷的發生機制。

材料與方法

1.材料與試劑：鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)(美國Sigma-Aldrich公司)，anti-miR-214和陰性對照Scrambled anti-miR(美國Exiqon公司)，L-NAME(美國Cayman Chemical公司)；尿白蛋白檢測試劑盒(英國Abcam公司)， eNOS ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，M-MLV反轉錄酶(美國Promega公司)，TaqMan檢測試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，2×SYBR Green Color qPCR Mix試劑盒(上海怡澤生物科技有限公司)。

2.實驗動物及模型制備：所有動物實驗和程序均經上海交通大學附屬第六人民醫院動物保護倫理學委員會批準(倫理審批號：DWLL2022-0521)。選取6～7周雄性SD大鼠72只，體質量250±20g，SPF級，購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部，實驗動物設施許可證號：SYXK(滬)2021-0028。對SD大鼠行腹腔注射單劑量65mg/kg STZ(溶于0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.5)，注射3天后測空腹血糖，>16.7mmol/L提示糖尿病大鼠建模成功。

3.實驗分組：(1)探討miR-214在糖尿病大鼠腎組織中的動態變化：利用6～7周雄性SD大鼠36只，分為對照組與STZ誘導的糖尿病組，分別于糖尿病發生后0、1、2、6周處死動物，觀察大鼠腎組織miR-214及尿白蛋白變化。(2)探討miR-214是否促進糖尿病腎損傷的發生及其潛在機制：將36只大鼠隨機分為對照組，STZ誘導的糖尿病模型(STZ)組，Scrambled anti-miR處理(STZ+Scrambled anti-miR)組，anti-miR-214處理(STZ+anti-miR-214)組，Scrambled anti-miR聯合L-NAME處理(STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME)組與anti-miR-214聯合L-NAME處理(STZ+anti-miR-214+L-NAME)組。STZ誘導成糖尿病后7周對動物予以anti-miR-214(10mg/kg，腹腔注射，兩周1次)處理；L-NAME處理組在注射anti-miR-214或Scrambled anti-miR的同時施加L-NAME。STZ誘導為糖尿病后13周處死各組動物，取血、尿與腎組織標本。

4.生化分析：按照ELISA 試劑盒說明書檢測尿白蛋白和eNOS水平。

5.組織學分析：腎組織采用10%甲醛固定，經石蠟包埋，3μm 連續切片，脫蠟、水化后，行高碘酸-希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色。隨機選取10個400倍視野，用 Image J 軟件測量每個視野下PAS染色陽性無核區腎小球膜基質面積，計算細胞外基質面積占腎小球面積的百分比，即腎小球系膜基質擴張系數。

6.qRT-PCR：用 TRIzol 法提取組織RNA，進一步反轉錄為cDNA。參照TaqMan檢測試劑盒的說明方法，以5S rRNA作為內參，應用StepOnePlus定量PCR儀(美國 ABI 7500)檢測miR-214的表達。其他基因mRNA，以18S rRNA為內參，按2×SYBR Green Color qPCR Mix試劑盒的說明方法進行擴增。MCP-1上游引物：5′-GTGCTGACCCCAATAAGGAA-3′，下游引物：5′-TGAGGTGGTTGTGGAAAAGA-3′；TGF-β1上游引物：5′-AATACGTCAGACATFCGGGAAGC-3′，下游引物：5′-TCAATGTACAGCTGCCGTACAC-3′；eNOS上游引物：5′-CAGCCACGTTAATTTCCACTG-3′， 下游引物：5′-GACCCTCACCGATACAACATAC-3′； 18S rRNA上游引物：5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′， 下游引物：5′-CCTGTATTGTTATTTTTCGTCACTACCT-3′。

結 果

1.糖尿病大鼠腎組織miR-214與尿白蛋白動態變化：糖尿病大鼠腎組織miR-214在STZ 誘導后第1、2、6周顯著升高。蛋白尿在糖尿病誘導成功后的第2周開始出現，較于腎組織miR-214出現顯著變化延遲了1周(<0.05，圖1)。

2.anti-miR-214促進糖尿病大鼠腎小球eNOS mRNA和腎皮質eNOS 蛋白的表達：如圖2所示，與對照組比較，糖尿病大鼠腎小球eNOS mRNA和腎皮質eNOS蛋白表達明顯增加(<0.05)。抑制miR-214表達可進一步上調腎小球eNOS mRNA和腎皮質eNOS蛋白水平(與STZ+Scrambled anti-miR組比較，<0.05)；eNOS抑制劑L-NAME不影響anti-miR-214對eNOS的表達調控(與STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME組比較，<0.05)。

3.miR-214/eNOS軸參與糖尿病大鼠蛋白尿的發生：如圖3所示，與對照組比較，糖尿病大鼠空腹血糖和尿白蛋白水平明顯增加(<0.05)；利用anti-miR-214抑制miR-214表達明顯減輕糖尿病大鼠蛋白尿(<0.05)，但不影響血糖水平(>0.05)。進一步研究顯示，eNOS抑制劑L-NAME使anti-miR-214對糖尿病大鼠蛋白尿的保護作用消失(與STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME組比較，>0.05)，這提示miR-214通過調控eNOS參與糖尿病大鼠蛋白尿的發生。

4.miR-214/eNOS軸參與糖尿病大鼠腎損傷：如圖4所示，與對照組比較，STZ誘導的糖尿病大鼠體質量減輕，腎肥大指數增加，系膜基質增生(<0.05)。anti-miR-214顯著減輕糖尿病大鼠腎肥大，改善系膜基質增生(與STZ+Scrambled anti-miR組比較，<0.05)，但對糖尿病大鼠體重無顯著影響(>0.05)。eNOS抑制劑L-NAME使anti-miR-214對糖尿病大鼠的腎臟保護作用消失(STZ+anti-miR-214+L-NAME組與STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME組比較，腎肥大指數和腎小球系膜擴張系數差異無統計學意義，>0.05)，這提示miR-214通過調控eNOS參與糖尿病大鼠腎損傷機制。

5.miR-214/eNOS軸調控糖尿病大鼠腎組織TGF-β1和MCP-1的表達：如圖5所示，與對照組比較，糖尿病大鼠的腎皮質TGF-β1和MCP-1表達顯著增高(<0.05)。anti-miR-214抑制了TGF-β1和MCP-1的表達(與STZ+Scrambled anti-miR組比較，<0.05)，eNOS抑制劑L-NAME顯著抑制了anti-miR-214介導的TGF-β1和MCP-1表達上調(與STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME組比較，>0.05)，這提示miR-214通過調控eNOS參與調節糖尿病大鼠腎組織TGF-β1和MCP-1的表達。

討 論

本研究表明，糖尿病大鼠腎組織miR-214表達明顯上調。抑制miR-214表達減輕了糖尿病大鼠白蛋白尿，腎肥大和腎小球系膜基質增生，其機制可能是通過上調eNOS表達，達到保護糖尿病腎損傷的作用。

miR-214是一種重要的miRNA，在多種腎損傷模型中被顯著上調。筆者發現糖尿病大鼠腎組織中高表達，抑制miR-214改善了糖尿病腎損傷。糖尿病腎病早期主要表現為持續的微量白蛋白尿。本研究發現，anti-miR-214可以降低糖尿病大鼠蛋白尿，但對血糖無影響，表明anti-miR-214介導的腎保護作用與血糖調控機制無關。腎小球肥大和系膜外基質積聚是DKD的重要特征。

TGF-β1是一種重要的促纖維化因子，它調控系膜細胞肥大，增加膠原蛋白合成，促進系膜外基質積聚，最終導致糖尿病腎病腎小球硬化。MCP-1也被報道直接參與細胞外基質合成，并在糖尿病腎病的發病機制中發揮重要的促炎作用。筆者研究發現，anti-miR-214可顯著減輕糖尿病大鼠腎肥大，改善腎小球系膜基質增生，同時下調腎組織TGF-β1與MCP-1的表達水平。

已有研究表明，miR-214通過抑制PTEN表達加重db/db小鼠腎小球系膜肥大和細胞外基質積聚。筆者既往研究表明，除PTEN外，eNOS也是miR-214的靶標，參與miR-214對血壓的調控。內皮功能障礙是DKD早期病理異常的標志，eNOS是內皮細胞合成NO的限速酶，其功能失調或表達降低會導致內皮功能障礙。與野生型小鼠比較，eNOS敲除的糖尿病小鼠表現出更明顯的白蛋白尿和腎小球病變。臨床研究表明，eNOS基因多態性與糖尿病腎病的發生風險相關。本研究顯示，在糖尿病大鼠腎活檢中腎小球eNOS表達增高，抑制miR-214上調了糖尿病大鼠腎組織eNOS水平并改善糖尿病腎損傷。此外，eNOS抑制劑L-NAME使anti-miR-214對糖尿病大鼠的腎臟保護作用消失，提示miR-214可能通過抑制eNOS表達參與DKD的發生和發展。

綜上所述，本研究結果表明，miR-214/eNOS軸可能參與了糖尿病大鼠腎損傷的分子機制；抑制miR-214的表達可減輕糖尿病腎損傷，為臨床DKD防治提供了新思路。在本研究使用了STZ誘導的糖尿病大鼠模型來探討anti-miR-214的腎保護作用，該模型無法完全模擬臨床糖尿病腎病。未來需要進一步使用更理想動物模型、基于更大的樣本量開展miR-214/eNOS軸參與糖尿病腎損傷的分子機制研究。