氯仿和鄰苯二甲酸二辛酯聯(lián)合暴露對(duì)小鼠脾臟內(nèi)LDH及ATP酶的影響

王明霞 梁 虹 李吉平 陳明琪 杜琳琳

鄰苯二甲酸酯類(PAEs)作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物存在于多種環(huán)境介質(zhì)中，并通過(guò)食物鏈逐漸累積，具有多種損害作用，如肝臟毒性、生殖毒性、免疫毒性、水生和陸生生物的生態(tài)毒性效應(yīng)、神經(jīng)行為發(fā)育異常、胰島素抵抗、肥胖、哮喘和過(guò)敏性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)腫瘤等。鄰苯二甲酸二辛酯(dioctylphthalate，DOP)屬于優(yōu)先控制的環(huán)境污染物。氯仿(chloroform，CF)能夠?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)、心臟、肝臟、腎臟等產(chǎn)生損害作用，抑制農(nóng)作物、水生生物生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致中毒死亡。DOP和CF均可通過(guò)多種暴露途徑進(jìn)入機(jī)體，混合物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)可能不同于其單一毒性，因而研究其共同暴露對(duì)機(jī)體的聯(lián)合毒性影響具有重要的意義。課題組前期已就二者對(duì)小鼠腦組織、肝臟、腎臟、心肌組織等的聯(lián)合毒性影響進(jìn)行研究。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，又是發(fā)揮免疫應(yīng)答和免疫效應(yīng)的場(chǎng)所，本研究通過(guò)檢測(cè)小鼠脾臟中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)及ATP酶的活力，探討DOP和CF對(duì)小鼠是否具有免疫損傷作用，對(duì)后續(xù)進(jìn)一步深入研究具有借鑒意義。

材料與方法

1.主要儀器與試劑：電子天平(TLE204E)購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(LDZ5-2)購(gòu)自北京醫(yī)用離心機(jī)廠；數(shù)顯三用恒溫水箱(HH-W600)購(gòu)自金壇市醫(yī)療儀器廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(T6)購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DOP(分析純)購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；CF(分析純)購(gòu)自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司；LDH試劑盒、ATP酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所。

2.動(dòng)物的分組與染毒：選擇健康成年雌性昆明小鼠20只，體質(zhì)量為25±2g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001]，飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[使用許可：SYXK(黑)2016-001]。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠正常攝食、飲水，飼養(yǎng)溫度21～23℃，相對(duì)濕度65%，自然晝夜交替。將小鼠隨機(jī)分為4組，分別為540mg/kg DOP+112mg/kg CF(DOP+CF)組、540mg/kg DOP(DOP)組、112mg/kg CF(CF)組和玉米油(對(duì)照組)，每組5只。采用等容積灌胃法(10ml/kg)，1次/天，連續(xù)染毒15天。

3.臟器系數(shù)計(jì)算：染毒結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，取臟器，稱量脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟系數(shù)(%)=脾臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

4.小鼠脾勻漿中LDH、ATP酶的測(cè)定：將脾臟組織與0.9%NaCl注射液按1∶9的比例制備成初始濃度為10%的勻漿液，以4000r/min離心10min，取上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行LDH、ATP酶檢測(cè)。LDH檢測(cè)時(shí)按步驟加入樣本和基質(zhì)緩沖液、輔酶Ⅰ，混勻后37℃孵育15min，加入2，4-二硝基苯肼，混勻后再次37℃孵育15min，加入NaOH溶液室溫放置3min，440nm波長(zhǎng)，1cm光徑比色測(cè)定；ATP酶按照酶促反應(yīng)→定磷→660nm波長(zhǎng)，1cm光徑，比色測(cè)定。

結(jié) 果

1.小鼠脾臟質(zhì)量及脾臟系數(shù)的結(jié)果分析：各組小鼠脾臟質(zhì)量及脾臟系數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為0.032、0.405，均>0.05)，DOP和CF聯(lián)合染毒對(duì)小鼠脾臟質(zhì)量、脾臟系數(shù)的影響均未見(jiàn)交互作用(分別為0.006、0.033，均>0.05，表1)。

2.小鼠脾臟中LDH、ATP酶的測(cè)定結(jié)果分析：各組小鼠脾臟Na-K-ATP酶活力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=3.142，>0.05)，各組小鼠脾臟LDH、Ca-Mg-ATP酶活力比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為8.000、8.585，均<0.01)。與對(duì)照組比較，CF組LDH活力升高，各染毒組Ca-Mg-ATP酶活力均降低(均<0.05)；與DOP組比較，僅CF組LDH活力升高(<0.01)；與CF組比較，DOP+CF組LDH活力降低(<0.01)。DOP和CF聯(lián)合染毒對(duì)小鼠脾臟LDH、Na-K-ATP酶、Ca-Mg-ATP酶的影響未見(jiàn)交互作用(分別為2.532、1.191、2.261，均>0.05，表2)。

討 論

LDH廣泛分布于血流豐富的器官和細(xì)胞中，是糖酵解的關(guān)鍵酶，在臨床診斷上有較高的敏感度，但特異性較差。LDH和ATP在機(jī)體的能量供應(yīng)方面起著重要作用。

本研究中各組小鼠體質(zhì)量、脾臟系數(shù)的變化比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與染毒劑量及染毒時(shí)間短有關(guān)，尚未表現(xiàn)出差異性，有待于進(jìn)一步進(jìn)行研究。各染毒組小鼠脾臟中的Ca-Mg-ATP酶活力均低于對(duì)照組，提示DOP、CF使ATP損耗多，能量大量消耗，自由基產(chǎn)生增加，自由基可直接作用于酶上的活性基團(tuán)引起基團(tuán)結(jié)構(gòu)變化而使酶活性發(fā)生改變，也可引起酶蛋白周圍的脂類過(guò)氧化使酶活性發(fā)生改變，導(dǎo)致Ca-Mg-ATP酶活性下降。對(duì)自由基與Na-K-ATP酶和Ca-Mg-ATP酶活性關(guān)系研究結(jié)果顯示，細(xì)胞膜Na-K-ATP酶和Ca-Mg-ATP酶活性降低，膜脂質(zhì)過(guò)氧化顯著增高。自由基對(duì)Ca-Mg-ATP酶活性產(chǎn)生影響，使細(xì)胞內(nèi)Ca排出障礙，細(xì)胞內(nèi)Ca含量升高，導(dǎo)致組織供氧減少，從而加重脂質(zhì)過(guò)氧化及自由基的損害，進(jìn)一步降低了Ca-Mg-ATP酶活性。

細(xì)胞外鈣內(nèi)流激活蛋白激酶和磷脂酶，使機(jī)體損傷進(jìn)入惡性循環(huán)，繼而影響LDH等酶活性的改變，能量供應(yīng)障礙，脾臟內(nèi)的免疫活性物質(zhì)合成與釋放減少，可能導(dǎo)致免疫功能紊亂的發(fā)生，同時(shí)對(duì)各種感染性因素的防御能力降低。通過(guò)與對(duì)照組及DOP組比較，僅CF組小鼠脾臟LDH活力發(fā)生改變，推測(cè)可能是脾臟對(duì)CF的敏感度強(qiáng)于DOP。DOP和CF同時(shí)暴露后，小鼠脾臟LDH、Na-K-ATP酶、Ca-Mg-ATP酶的影響均未見(jiàn)交互作用。

存在的不足：①本研究?jī)H提示了DOP和CF同時(shí)暴露可能導(dǎo)致機(jī)體免疫功能損傷，其具體機(jī)制尚不清楚；②本研究?jī)H是推測(cè)可能導(dǎo)致Ca-Mg-ATP酶活力降低的原因和其產(chǎn)生的后果，未進(jìn)一步探討脂質(zhì)過(guò)氧化、免疫活性物質(zhì)等指標(biāo)的變化；③本研究?jī)H是針對(duì)DOP和CF暴露和非暴露水平的研究，未進(jìn)行不同暴露水平的梯度實(shí)驗(yàn)研究。基于以上，有待于進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，DOP和CF同時(shí)暴露可能導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，且對(duì)小鼠脾臟LDH、ATP酶的影響未見(jiàn)交互作用。