乳鐵蛋白調控脂肪細胞發育代謝的研究進展

安 芹，汪 雄，王文利，程智美，戴蘊平，張雅麗,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國農業大學生物學院，北京 100083）

肥胖是世界范圍內一種主要的流行病，通常與代謝異常有關，主要特征是由前脂肪細胞的增殖和分化引起的脂肪細胞體積膨大以及脂肪細胞數量增加，從而導致脂肪組織過度積累。成熟的脂肪細胞可以分泌多種脂肪細胞因子和炎癥因子，過量的炎癥因子則會導致機體產生多種代謝性疾病，如高血壓、高血脂、胰島素抵抗、糖尿病、冠心病、脂肪肝和心腦血管疾病等并發癥。

近年來，研究發現作為母乳中重要成分的乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）具有多功能生物活性，可能是母乳喂養有利于嬰兒健康的原因之一。臨床研究發現，LF成功完整地通過人體上消化系統并非難以實現，這取決于食物攝入形態是液態還是固態，以及與什么食物同時攝入有關。嬰幼兒的消化系統發育尚未成熟，所以LF更容易完整地到達腸道。LF作為一種高附加值的食品配料越來越受到重視，除了可以添加到嬰兒配方奶粉中之外，LF還被認為在對抗肥胖方面可能起到重要作用。采用藥物、手術和飲食控制等方法治療肥胖大多存在降低機體免疫力、毒副作用大、容易反彈等缺點。全面地了解導致肥胖的機制可以促進更加有效的靶向治療技術發展。因此，探討LF對脂肪細胞的增殖分化、脂質代謝、炎癥反應的調節作用及其分子機制具有重要的意義。

1 乳鐵蛋白

LF是一種多功能的單多肽鏈糖蛋白，在生物體中廣泛存在，如乳汁、唾液、精液和黏膜表面等，幾乎所有的體液中都含有LF，LF最豐富的來源是乳汁，特別是初乳。LF在結構上與血清轉鐵蛋白相似，具有大約60%的序列同源性，可以可逆地結合鐵離子（Fe），所以LF也被歸類為轉鐵蛋白。來自哺乳動物的LF具有相似的氨基酸序列，人乳鐵蛋白與牛乳鐵蛋白（bovine lactoferrin，BLF）的序列同源性約為70%，而人與黑猩猩乳鐵蛋白的序列同源性約為97%。LF一級結構的相似性提示其在不同物種中具有類似的生物學功能。LF除了對鐵具有高親和性外，還具有抗菌、抗病毒、抗炎和抗癌等多種生物學活性。因其多種免疫功能，LF被視為是一種宿主防御介質。LF被越來越多地認為是一種安全且有效的活性成分，商業上可用的LF主要是從牛乳中提取，被廣泛應用于食品、醫療、化妝品等領域。例如，LF添加到嬰兒配方奶粉中可以有效提高嬰兒免疫力，預防嬰兒體質變弱；LF制備的納米粒子載體可以有效保護鐵等微量營養素；LF還可以通過抑制黑色素的產生、促進膠原蛋白的生成，達到美白、護膚的效果。

研究發現在肥胖患者中，LF基因在脂肪組織中的表達水平明顯偏低，其表達水平與脂肪生成和胰島素相關基因表達有關，并且與炎癥標志物表達水平呈負相關。脂肪組織中LF的來源主要是脂肪細胞，LF基因在脂肪組織中的表達可能與脂肪細胞生理活動有關。動物研究表明，LF可以參與調節脂肪細胞的生長和分化，對于脂質代謝具有調控作用，可能與調控脂肪發育代謝相關基因的表達水平有關，但是具體的調節機制需要進一步驗證。

2 脂肪細胞

脂肪組織被認為是內分泌器官，在2型糖尿病和癌癥等疾病中起著重要作用。脂肪組織缺乏又稱脂肪營養不良，而脂肪組織過量會導致肥胖。脂肪組織在調節人體能量平衡和營養穩態方面發揮著重要作用，主要由脂肪細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、組織細胞和間充質干細胞等組成。根據沉積部位，可以將脂肪組織分為皮下脂肪組織、內臟脂肪組織和異位脂肪組織。皮下脂肪組織主要起到提供熱量以及儲存能量的作用，內臟脂肪組織分布在臟器周圍，對內臟器官具有支撐、穩定和保護的作用。相較于皮下脂肪組織，內臟脂肪組織具有更強的代謝活性，被認為是主要的促炎組織，可以產生多種脂肪因子和炎癥介質，更容易引起高血壓、血脂異常等代謝綜合征。異位脂肪組織的產生是由于脂代謝紊亂，如高脂飲食導致產生過多游離脂肪酸，進而導致脂質在肝臟、肌肉等非脂肪組織中沉積。皮下脂肪組織無法擴張時會引起內臟和異位脂肪組織的堆積，內臟脂肪組織和異位脂肪組織均具有明顯的代謝特性，是導致心血管疾病和代謝風險的主要因素。根據顏色、形態、結構和功能的不同，脂肪組織又可以分為白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）和棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）。皮下白色脂肪有腹股溝脂肪、腋下脂肪和甲狀腺旁脂肪等，內臟白色脂肪有附睪旁白色脂肪、腸系膜周圍脂肪和腎周脂肪等。其中，典型的皮下白色脂肪為腹股溝脂肪，典型的內臟白色脂肪為附睪脂肪，肩胛下棕色脂肪為典型的棕色脂肪。WAT是一種重要的內分泌器官，其中的脂肪細胞主要是由圓形的大脂滴和邊緣的細胞質和細胞核組成，以甘油三酯的形式儲存多余的能量，主要通過分泌脂肪因子、炎癥因子影響機體代謝。而BAT中的脂肪細胞主要是通過線粒體解偶聯蛋白-1（uncoupling protein-1，UCP-1）發揮產熱、耗能作用。脂肪組織可以從體質量的2%～3%增加到60%～70%，其質量增加涉及多種機制，包括脂肪干細胞增殖、脂肪細胞數目增加、脂肪細胞體積增大等。

脂肪細胞來自于脂肪組織中存在的與骨髓基質一樣的間充質干細胞，此干細胞被稱為脂肪源性干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs），具有活力持久、能夠自我更新和多向分化等特征。脂肪細胞壽命有限，ADSCs會不斷分化為新的脂肪細胞，成年人的脂肪細胞數量處于動態平衡狀態。ADSCs可以在保持干細胞活躍增殖特性的同時，在成脂信號因子的刺激下分化為脂肪細胞前體，也稱為前脂肪細胞。脂肪細胞前體經過反復接觸抑制及細胞融合等階段，在成脂誘導條件下開始分化為不成熟的脂肪細胞，并最終完成向成熟脂肪細胞的完全分化。即脂肪細胞的成脂分化過程為ADSCs、脂肪細胞前體、不成熟的脂肪細胞、成熟脂肪細胞，具體過程如圖1所示。在分化的過程中，脂肪細胞形態發生改變，開始是成纖維細胞樣，之后細胞體積變大成圓形或者類似圓形，細胞質中出現小脂滴，因此這個階段的細胞也被稱為多小室脂肪細胞，即不成熟的脂肪細胞；在脂肪細胞分化后期，脂滴逐漸增大并合并成大的脂滴，引起脂質堆積，從而獲得成熟脂肪細胞的形態特征，即脂肪細胞形態由梭形完全變成圓形，并失去分裂增殖能力，此階段細胞稱為單室脂肪細胞，即成熟的脂肪細胞。成熟的脂肪細胞可以表達分泌多種脂肪細胞因子和炎癥因子，如瘦素、脂聯素、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，作用于不同的組織器官，引發炎癥，進而引起疾病。

圖1 脂肪細胞生命周期Fig. 1 Life cycle of adipocytes

研究發現，肥胖可以改變ADSCs的多向分化能力、增殖能力以及能量代謝。在脂肪細胞增殖分化及代謝相關研究中，常用脂肪細胞系或原代脂肪細胞進行實驗，最常用的研究脂肪細胞的方法為體外培養。3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞系是一種被廣泛用來研究對脂肪生成影響的細胞系，它是從3T3細胞中經克隆分離得到的可以連續傳代的亞系。原代脂肪細胞分離自脂肪組織中的血管基質組分細胞，血管基質組分細胞是一個細胞群，其中包含ADSCs等多種細胞。

3 乳鐵蛋白調控脂肪干細胞的增殖分化

動物脂肪組織中分布著處于各個分化階段的脂肪細胞。脂肪細胞從脂肪細胞前體向成熟脂肪細胞發展過程中，細胞數量逐漸增多，細胞體積逐漸增大，脂質逐漸沉積。脂肪細胞數量過多或脂肪細胞體積過大會導致肥胖，脂肪質量的過度增加導致脂肪組織功能失調。高脂飲食所致動物肥胖模型與人類因能量攝入過多而形成的肥胖最為接近，目前也已經得到廣泛應用。動物實驗表明LF可以降低肥胖小鼠內臟脂肪的質量，改善高脂飲食誘導的肥胖。

ADSCs位于血管周圍，其分裂分化受到各種抑制和刺激因素的嚴格調控。ADSCs具有穩定生長和增殖的能力，在不同的誘導條件下可以定向分化為各種中胚層細胞，如脂肪細胞、軟骨細胞、心肌細胞、甚至神經細胞。研究發現LF可以促進兔脂肪干細胞以及人脂肪干細胞的成骨分化。細胞膜相關酶堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）在成骨細胞分化過程的早期出現，是最廣泛用于識別成骨細胞分化的標志，其活性與礦化開始前成骨細胞基質形成相關。骨鈣素（osteocalcin，OCN）參與控制骨礦化過程，出現在成骨細胞分化的晚期；I型膠原蛋白（type I collagen，COL-I）是骨基質中最豐富的蛋白質，在增殖過程中mRNA高水平表達。研究發現LF干預可以顯著增加ALP活性，并且ADSCs的OCN和COL-I表達水平經LF干預之后均顯著增加。這些結果均表明LF可以增強ADSCs的成骨分化能力。

通過對脂肪生成的轉錄途徑研究發現，一些轉錄因子，如過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）、CCAAT增強子結合蛋白（CCAAT-enhancer binding proteins，C/EBPs）、固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs），在脂肪細胞分化所需的轉錄激活中起著關鍵作用。其中，PPARγ對脂肪生成必要且充分，是脂肪細胞分化的主要調節因子。C/EBPs包含多種亞型，其中主要是C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ參與脂質代謝過程，這些轉錄因子可以與PPARγ在脂肪生成過程中形成級聯反應。脂肪生成的刺激信號使脂肪細胞分化的早期調節因子C/EBPβ、C/EBPδ表達量增加，進一步激活PPARγ，PPARγ反過來促進C/EBPα的表達，這些分子共同誘導脂肪細胞分化以及脂質儲存。研究發現，灌胃BLF導致大鼠腸系膜脂肪組織的前脂肪細胞C/EBPα、PPARγ的基因表達降低，并且顯著降低C/EBPδ的基因表達水平，說明BLF可能參與調控前脂肪細胞的早期和晚期分化。Moreno-Navarrete等研究發現外源性LF添加可以降低3T3-L1細胞分化過程中PPARγ及其下游與脂肪生成有關的基因表達水平。這些結果可能揭示了LF抑制脂肪細胞分化的基礎機制。

然而，在人脂肪細胞培養實驗中發現，LF可以上調人皮下和內臟前脂肪細胞中PPARγ的表達。因此，LF通過PPARγ調控脂肪生成的確切機制需要進一步確定。

4 乳鐵蛋白調控脂質代謝

脂質代謝分為分解代謝和合成代謝，脂質代謝過程受多種轉錄因子的調控，脂質合成與降解之間的平衡決定脂肪細胞的脂質含量。研究發現，在脂肪細胞分化過程中脂肪生成相關基因表達水升高。而另外有研究發現，在人脂肪細胞分化過程中LF表達水平增加，LF基因的表達與脂肪生成相關基因的表達水平呈正相關，表明LF參與脂肪細胞代謝。

4.1 脂質分解

激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL）是甘油三酯降解的主要酶，GHSL催化是脂肪分解的限速步驟。研究發現LF可以上調HSL的表達水平從而促進脂肪分解。在環腺苷酸-蛋白激酶A（cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A，cAMP-PKA）信號通路中，標準的脂質分解途徑為：G蛋白偶聯受體激活腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC），激活的AC可以合成cAMP，進一步激活PKA，而PKA可以磷酸化并激活HSL，最終導致脂滴分解。脂滴包被蛋白（perilipin，PLIN）位于脂滴表面，對脂滴具有保護作用，可以阻止HSL與甘油三酯接觸，抑制HSL的脂解作用。脂肪細胞在脂解刺激下，激活后的PKA可以磷酸化PLIN，并將HSL由細胞質轉移到脂滴表面，導致脂解反應。Ikoma-Seki等研究發現LF可以激活脂肪細胞PKA活性，并且增加HSL以及PLIN的磷酸化水平。這些研究結果表明LF可以激活成熟脂肪細胞的標準脂解途徑。cAMP響應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREBP）是一種轉錄因子，位于cAMP-PKA信號通路下游，可以被PKA磷酸化激活。HSL和AC的5′-非翻譯區（5′-untranslated region，5′-UTR）含有cAMP響應元件（cAMP response element，CRE）或類似于CRE的位點，可以被轉錄因子識別。Ikoma-Seki等研究發現LF能夠激活CREBP，并且上調HSL的表達水平以及誘導AC的合成。研究發現低密度脂蛋白受體相關蛋白1（low density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1）可能是LF位于脂肪細胞中的受體。LF可以通過LRP1控制細胞外信號調節激酶信號通路的活性，調節參與脂解的蛋白質的表達水平來促進成熟脂肪細胞的脂解。Nakamura等研究發現BLF可以借助LRP1受體通過cAMP-PKA信號通路促進棕色脂肪細胞中基因的表達，導致能量消耗增加。其中，UCP-1在棕色脂肪細胞的線粒體內膜高度表達，它通過將質子梯度耗散為熱來消耗游離脂肪酸產生的能量。另外，沉默基因之后可以減輕LF促進大鼠腸系膜脂肪細胞脂質分解的作用，這進一步表明了LRP1可以作為脂肪細胞中LF的受體。

因此，LF調控脂肪細胞脂代謝模式如圖2所示，LF可能經受體LRP1進入脂肪細胞，通過上調AC的表達激活cAMP-PKA信號通路，PKA通過磷酸化并激活參與脂質分解的酶HSL，從而促進脂肪細胞的脂質分解。但是，LF誘導脂肪細胞脂解的具體機制需要進一步研究。

圖2 LF調控脂肪細胞脂代謝模式圖（基于大、小鼠等模式動物）Fig. 2 Patterns by which LF regulates lipid metabolism of adipocytes(based on model animals such as rats and mice)

4.2 脂肪生成

FAS和ACC是脂肪酸合成的關鍵酶，其合成基因是SREBPs的下游基因，SREBPs是脂質代謝的主要參與者，控制著脂質合成和轉運相關的重要基因的表達，SREBP-1是SREBP的一種亞型，在誘導脂肪基因表達中起著重要作用。Min Qingqing等研究發現外源性LF給藥可以顯著下調SREBP-1及其下游脂肪酶FAS和ACC的表達水平，調節脂質代謝。Xiong Ling等研究同樣表明LF可以抑制肥胖小鼠肝臟和附睪脂肪組織FAS表達。如圖2所示，研究發現LF可以通過增加3T3-L1細胞中腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）磷酸化水平來抑制脂肪合成。AMPK可以作為一種傳感器感知能量狀態并根據代謝需要調節代謝通路。AMPK被磷酸化激活，激活后的AMPK可以增強補充細胞ATP供應的信號轉導通路，如脂肪酸氧化，并且抑制消耗ATP的生物合成過程，如脂質合成。AMPK可以通過直接磷酸化SREBP-1而影響其下游靶基因轉錄，或者是磷酸化FAS和ACC而影響其酶活性，在脂質代謝中發揮關鍵性作用。Moreno-Navarrete等研究發現LF可以通過增加AMPK的磷酸化水平，并且抑制FAS和ACC的表達來減少脂滴的形成。研究人員通過動物研究發現脂肪細胞中脂滴過量積累會造成肝臟變性，而外源性LF可以通過減少脂滴的形成從而降低這一不利影響。與此一致，視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）過磷酸化導致活性降低，促進3T3-L1細胞克隆擴張和脂肪細胞分化，而LF可以通過增加低磷酸化的RB水平來抑制3T3-L1的脂肪生成。研究發現經胰蛋白酶處理的LF因產物較大繼續表現出抑制脂肪生成的作用，而用胃蛋白酶處理LF產生非常小的肽導致其失去抗脂肪生成的活性。因此，在將LF作為口服內臟減脂劑時有必要將腸溶涂層納入考慮范圍。

然而，研究發現在人原代脂肪細胞中，LF可以通過增強胰島素信號傳導并且抑制RB和AMPK活性來促進脂肪生成。前列腺六次跨膜蛋白2（six transmembrane protein of prostate 2，STAMP2）在脂肪細胞生理活性中起著重要作用，敲除基因可以破壞胰島素敏感性和脂肪生成。研究發現LF可以顯著上調基因表達，這也是LF增強人前脂肪細胞胰島素信號傳導和脂肪生成的原因之一。另一個原因可能是人原代前脂肪細胞暴露于糖皮質激素增加了對胰島素的敏感性，并且增強了對脂肪生成刺激因素的后續響應，而且這種效應在3T3-L1細胞中并沒有觀察到。而LF基因敲除可以導致人脂肪生成相關基因的表達量顯著降低，這說明內源性LF生物合成是調控人脂肪細胞分化的關鍵。LF作為一種轉鐵蛋白，其對鐵平衡具有調節作用。研究發現鐵過量可誘導脂肪細胞中鐵的積累，導致胰島素抵抗，減少脂聯素的生成。而鐵穩態的破壞，無論是鐵過量還是鐵缺失均可以導致脂肪細胞功能受損，降低其脂肪生成能力。因此，LF對于鐵穩態的調節作用可能是其促進人脂肪細胞分化及脂肪形成的原因之一。

除此之外，LF對脂肪細胞脂質生成的雙重作用可能與LF受體不同有關。研究發現LRP1作為一種假定的LF受體，與脂滴發育的基因標記以及主要的成脂轉錄因子PPARγ的表達有關。而在大鼠腸系膜脂肪的前脂肪細胞中發現了LRP1的表達，并且結合LF對大鼠腸系膜脂肪組織的前脂肪細胞分化的抑制作用，可得出LRP1可能參與了LF對脂肪生成的抑制作用。但是，目前對人脂肪細胞中LF相關受體的研究較少。

無論是LF在3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞系和鼠原代脂肪細胞中的抑制脂肪生成作用，還是在人原代脂肪細胞中促進脂肪生成作用，均表明LF參與調節脂肪細胞的生理功能。因此，LF給藥可能是肥胖相關脂肪組織功能障礙或代謝紊亂的有效治療靶點，但是還需要進一步確定LF調控脂肪細胞脂質代謝的相關信號通路，以及探究LF基因對于鼠原代脂肪細胞生理功能的調控作用，即LF自分泌是否與外源性添加LF的效果一致。

5 乳鐵蛋白調控脂肪細胞因子

脂肪細胞具有內分泌功能，大量的脂肪細胞構成了脂肪組織。脂肪組織不僅能夠儲存能量，還可以保護內臟器官，緩沖劇烈運動對器官造成的損傷，但是脂肪組織沉積過多時，可能會由于過度的內分泌作用干擾內臟器官的正常運轉，從而導致疾病。脂肪組織慢性炎癥是肥胖相關疾病的重要病理過程。先天免疫系統由免疫細胞和體液免疫分子等組成，是抵御微生物入侵的首要防線之一，而LF作為一種先天免疫蛋白，具有抗炎特性，是哺乳動物宿主防線的重要組成部分。除脂肪細胞中含有LF受體之外，特定的LF受體還存在于多種細胞中，包括單核細胞、淋巴細胞、干細胞和內皮細胞。研究發現，LF可以通過調控脂肪細胞因子的分泌而參與調節機體健康。

脂肪組織是重要的內分泌器官，脂肪組織擁有獨特的免疫細胞庫，這些免疫細胞可以分泌各種細胞因子，如瘦素、脂聯素等。瘦素是脂肪組織特異表達的脂肪因子，是一種有助于抵抗肥胖的多肽類激素，可以調節食物攝入和能量消耗。Xiong Ling等研究表明LF可以通過增加血清中的瘦素水平，改善肝臟脂質代謝，進而改善肝臟脂肪變性。脂聯素是脂肪組織分泌的一種蛋白質，能夠通過脂聯素受體進入細胞，減少游離脂肪酸進入肝臟，是目前發現的唯一一個與肥胖呈負相關的細胞因子。而研究發現LF可以增加人皮下和內臟脂肪細胞中脂聯素基因和蛋白質表達水平。

脂肪細胞是促炎細胞因子的重要來源，成熟的脂肪細胞可以分泌表達多種炎癥因子，如MCP-1、TNF-α等，這些炎癥因子會導致全身性慢性炎癥，進而引發疾病。MCP-1是炎癥反應重要的趨化因子，通過募集單核細胞/巨噬細胞，以及介導靶細胞對細胞因子的分泌參與病理性新血管的生成。研究發現LF可以抑制肥胖小鼠肝臟和附睪脂肪組織中MCP-1的表達。同樣地，LF還可以恢復3T3-L1細胞中炎癥誘導的AKT磷酸化水平的降低，減少內臟脂肪細胞和皮下脂肪細胞中、和基因的表達水平。Mohamed等研究發現LF可以通過降低核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）下游相關指標從而降低炎癥介質的表達水平。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以誘導NF-κB與TNF-α啟動子的結合導致炎癥，而LF能夠結合LPS從而減少炎癥因子的產生。這可能是LF可以減輕炎癥的原因之一。

6 結 語

綜上所述，LF可以有效調控脂肪細胞的發育和代謝，其作用機制主要包括LF參與調節脂肪細胞增殖分化相關基因和參與脂代謝相關蛋白的表達水平等，表明LF可能是調節脂肪組織功能障礙或代謝紊亂的有效靶點。但目前LF確切的作用機制以及相應的表達受體等一系列問題需要繼續深入研究。人體內許多細胞可以表達分泌LF，這些內源性的LF對機體代謝可能存在著調控作用。其次，通過飲食補充LF從而影響機體脂肪細胞生理作用的詳細機制尚不明確。嬰幼兒的消化系統相較于成年人尚未成熟，并且腸道屏障不完善，很多蛋白質可以被直接吸收，所以研究LF在進入嬰幼兒體內后對其脂肪細胞的發育和代謝的影響意義重大。最后，目前LF調節脂肪細胞生理功能的研究主要集中在細胞和動物領域，而在人體臨床方面的研究較少。動物和人體在有效劑量和吸收代謝方面差異較大，體外實驗、動物實驗與人體臨床試驗的效果還存在差距，嬰幼兒、青少年和成人分別所需的LF有效劑量有待研究。