復方魚鵝滴鼻劑對過敏性鼻炎大鼠的干預作用及機制Δ

屈相玲，駱紅梅，熊成歡，劉明，馮果#（.貴州中醫藥大學第二附屬醫院藥學部，貴陽 55000；.貴州中醫藥大學藥學院，貴陽 55005）

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）即變應性鼻炎，是鼻炎中最常見的類型，臨床表現為反復發作的鼻癢、鼻塞、打噴嚏及頭痛等[1]。流行病學研究表明，AR已經對20%～30%的成人和多達40%的兒童的生活質量產生了顯著的負面影響，如AR會干擾睡眠，導致患者工作和學習表現不佳等[2]。盡管目前已有諸多治療AR的藥物，如鼻用糖皮質激素類藥物及抗組胺藥物等，但這些藥物不僅治療效果有限，而且還會導致患者鼻出血、體質量增加或心臟毒性等不良反應[3-4]。因此，尋找新的安全、可靠、療效佳的治療藥物迫在眉睫。有研究指出，AR主要由外界的過敏性抗原進入鼻黏膜并與相應的免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）結合而引起[5]，其嚴重程度與IgE水平呈正相關[6]。研究證實，當敏感機體鼻黏膜接觸到過敏原后，B淋巴細胞會迅速合成IgE，在IgE的介導下，肥大細胞脫顆粒釋放出炎癥介質，從而誘發過敏反應，因此IgE是AR發病的關鍵因素[7]。同時，外周血1型輔助性T細胞（type 1 helper T cells，Th1）和2型輔助性T細胞（type 2 helper T cells，Th2）間的免疫失衡也是AR發病的原因之一，即Th1和Th2細胞分泌的多種細胞因子相互作用使得Th1/Th2平衡被打破，T淋巴細胞分化失衡，進而導致大量炎癥介質（如組胺）被釋放，引發AR的各類癥狀[8-9]。

復方魚鵝滴鼻劑是貴州中醫藥大學第二附屬醫院研發的新型醫院制劑，主要由魚腥草、鵝不食草、冰片等藥物組成，具有清熱解毒、除濕祛濁、芳香通竅等功效。前期藥理學研究顯示，復方魚鵝滴鼻劑具有抗炎、抑菌、解熱鎮痛及抗過敏等藥理作用[10-12]；臨床研究表明，復方魚鵝滴鼻劑對AR、急慢性鼻炎、鼻竇炎均具有顯著療效[13-14]。因此，本研究以復方魚鵝滴鼻劑為干預藥物，以卵清蛋白復制的AR模型大鼠為研究對象，觀察模型大鼠鼻黏膜組織病理學改變，并檢測血清中IgE、白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-13、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平及鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達水平，從Th1/Th2平衡的角度探討該藥對AR模型大鼠的改善作用，以期為厘清復方魚鵝滴鼻劑治療AR的作用機制和進一步研究開發提供理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有HSZ-HS3型顯微鏡（重慶光學儀器廠），VG3S025型振蕩器[艾卡（廣州）儀器設備有限公司]，JY200C型電泳儀、JY-SCZ4+型垂直電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司），TGL-20M型離心機（長沙邁佳森儀器設備有限公司），MK3型全功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

復方魚鵝滴鼻劑（批號20190712，規格10 mL/瓶）由貴州中醫藥大學第二附屬醫院藥學部提供；曲安奈德鼻噴霧劑（陽性對照藥，批號20190825，規格6 mL/瓶）購自昆明源瑞制藥有限公司；卵清蛋白（批號A8040）及IgE、IL-2、IL-13、TNF-α酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號分別為SEKRT-0132、SEKRT-0216、SEKRT-0365、SEKRT-0402）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔源TNF-α、IL-2、IL-13、β-actin抗體（批號分別為13265S、12227S、06274S、4967S）均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（批號ZB-2512）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0013S）購自上海碧云天生物技術有限公司；磷酸鋁凝膠購自韓國保寧制藥株式會社。

1.3 動物

SPF級健康合格的SD大鼠72只，雌雄各半，體質量180～220 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2014-0011。

2 方法

2.1 模型的建立

SD大鼠適應性喂養3 d后，隨機取12只作為空白對照組，其余大鼠參照文獻[15-16]采用卵清蛋白致敏法復制AR模型：將卵清蛋白（0.4 mg/mL）與同體積磷酸鋁凝膠（4 mg/mL）混勻后，每只大鼠腹腔注射1 mL（即每只大鼠腹腔注射0.2 mg卵清蛋白及2 mg磷酸鋁凝膠）致敏，間隔1 d致敏1次，連續7次。從首次致敏后第15天開始，以2%卵清蛋白溶液雙側滴鼻激發過敏反應，每鼻孔50 μL，每日1次，連續7 d。空白對照組大鼠予以等量無菌生理鹽水處理。第22天末次鼻腔激發過敏后30 min內采用“量化疊加記分法”對大鼠鼻部癥狀進行評分。按照表1的評分標準，綜合評分≥6分為成功造模。

表1 AR大鼠鼻部癥狀評分標準

2.2 分組及給藥

將造模成功的大鼠隨機分為模型組、曲安奈德組（陽性對照，0.026 mg/kg）和復方魚鵝滴鼻劑高、中、低劑量組（134.4、67.2、33.6 mg/kg），另設空白對照組，每組12只，雌雄各半。以上6組大鼠均滴鼻給藥（用移液槍取藥液），給藥劑量為0.1 μL/g，每天2次，連續給藥14 d；并于每天第2次給藥后1 h，以2%卵清蛋白溶液雙側滴鼻，每鼻孔20 μL，每天1次，連續14 d，維持過敏狀態，空白對照組和模型組大鼠滴鼻等量的無菌生理鹽水，且空白對照組大鼠不用維持過敏狀態。各給藥組大鼠的給藥劑量依據如下：成人（體質量60 kg）曲安奈德鼻噴霧劑臨床用藥劑量為每天220 μg，換算成大鼠等效劑量約為0.026 mg/kg；成人（體質量60 kg）復方魚鵝滴鼻劑臨床用藥劑量為9.6 mg/kg（以生藥量計），根據大鼠與人體表面積等效比計算出等效劑量，大鼠高、中、低劑量分別相當于人臨床等效劑量的2、1、0.5倍。

2.3 指標檢測

2.3.1 大鼠鼻部癥狀評分 在實驗第36天，于2%卵清蛋白溶液滴鼻后1 h，按照表1的評分標準在30 min內對大鼠的擦鼻次數、噴嚏個數、鼻腔分泌物和鼻腔炎癥情況進行評分。

2.3.2 大鼠血清中IgE和炎癥因子水平檢測 采用ELISA法進行檢測。評分結束后，大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液（10 mL/kg）進行麻醉，取腹主動脈血，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照各ELISA試劑盒說明書進行IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平檢測。

2.3.3 大鼠鼻黏膜病理學觀察 采用HE染色法進行觀察。大鼠處死后，每組隨機取6只，分離鼻黏膜組織，用多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，透明、浸蠟、包埋、切片、染色、脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察鼻黏膜病理情況。

2.3.4 大鼠鼻黏膜組織中各炎癥因子蛋白表達水平檢測 采用蛋白質印跡法進行檢測。取“2.3.3”項下每組剩余6只大鼠，分離鼻黏膜組織，用液氮迅速冷凍，-80℃冰箱保存。檢測時取出，在研缽中搗碎，加入細胞裂解液，低溫勻漿，以12 000 r/min離心10 min后，采用BCA法測定蛋白表達水平。將上述蛋白樣品變性后，取30 μg變性蛋白樣品，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入TNF-α、IL-2、IL-13和β-actin一抗，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，室溫孵育1 h，顯影，用全自動凝膠成像儀成像。采用Quantity One分析軟件分析，以目標蛋白與內參蛋白的灰度值比值表示各目標蛋白的表達水平。

2.4 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，符合正態分布時，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布時，采用非參數檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻部癥狀評分的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠鼻部癥狀明顯，擦鼻、噴嚏、鼻腔分泌物、鼻腔炎癥評分均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組（除復方魚鵝滴鼻劑中劑量組鼻腔炎癥評分、低劑量組擦鼻和鼻腔炎癥評分外）大鼠鼻部各項癥狀評分均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻部癥狀評分的影響（±s，n＝12，分）

表2 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻部癥狀評分的影響（±s，n＝12，分）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

鼻腔炎癥0 1.60±0.84a 0.60±0.79c 0.70±0.67c 1.00±0.94 1.40±0.84組別空白對照組模型組曲安奈德組復方魚鵝滴鼻劑高劑量組復方魚鵝滴鼻劑中劑量組復方魚鵝滴鼻劑低劑量組擦鼻0 1.90±0.86a 1.20±0.42b 1.20±0.36b 1.20±0.63b 1.50±1.20噴嚏0 1.60±0.52a 1.00±0.47c 1.10±0.32c 0.90±0.32c 1.10±0.32c鼻腔分泌物0 1.70±0.67a 0.70±0.48c 0.30±0.48c 0.60±0.35c 0.90±0.57c

3.2 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠血清中IgE和炎癥因子水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

表3 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠血清中IgE和炎癥因子水平的影響（±s，n＝12）

表3 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠血清中IgE和炎癥因子水平的影響（±s，n＝12）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

TNF-α/（pg/mL）106.67±31.39 298.75±48.05a 228.54±57.31b 216.67±62.69b 252.33±63.04c 252.17±74.39c組別空白對照組模型組曲安奈德組復方魚鵝滴鼻劑高劑量組復方魚鵝滴鼻劑中劑量組復方魚鵝滴鼻劑低劑量組IgE/（ng/mL）11.92±3.61 72.42±12.51a 40.67±9.22b 36.68±9.86b 58.00±19.75c 42.08±9.32b IL-2/（pg/mL）5.33±1.87 18.75±3.84a 12.25±4.92b 12.53±5.37b 11.25±4.94b 14.33±5.23c IL-13/（pg/mL）4.75±2.01 28.25±7.76a 21.92±5.59c 21.83±4.57c 22.42±5.29c 20.17±4.59b

3.3 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜病理情況的影響

空白對照組大鼠鼻黏膜組織形態正常；模型組大鼠鼻腔上皮層脫屑、變性，固有層出現嗜酸性粒細胞浸潤及水腫，血管擴張、充血；各給藥組大鼠鼻腔上皮層病理損傷較模型組均有所減輕，表現為鼻腔上皮層輕度變性、固有層輕度水腫、嗜酸性粒細胞少量浸潤。結果見圖1。

圖1 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜病理情況影響的顯微圖（×200）

3.4 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜組織中炎癥因子蛋白表達水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表4、圖2。

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織炎癥因子蛋白表達電泳圖

表4 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜組織炎癥因子蛋白表達水平的影響（±s，n＝6）

表4 復方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜組織炎癥因子蛋白表達水平的影響（±s，n＝6）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

IL-13/β-actin 0.192±0.038 0.552±0.103a 0.258±0.054b 0.332±0.057b 0.392±0.065b 0.438±0.061c組別空白對照組模型組曲安奈德組復方魚鵝滴鼻劑高劑量組復方魚鵝滴鼻劑中劑量組復方魚鵝滴鼻劑低劑量組TNF-α/β-actin 0.284±0.069 0.782±0.112a 0.532±0.097b 0.352±0.046b 0.388±0.074b 0.628±0.147c IL-2/β-actin 0.338±0.096 0.605±0.119a 0.335±0.112b 0.322±0.074b 0.437±0.096c 0.268±0.049b

4 討論

AR是發生在鼻黏膜的一種變態反應性疾病，屬中醫學“鼻鼽”范疇。中醫學認為，AR是由于衛表不固，風寒之邪乘虛而入，犯及鼻竅，津液停聚，最終導致壅塞鼻竅；治法宜以祛風、通竅、化痰為主[17]。復方魚鵝滴鼻劑具有清熱解毒、除濕祛濁、芳香通竅的功能，臨床用于治療急/慢性鼻炎、鼻竇炎和AR，可以明顯改善患者癥狀。

AR常由環境抗原（塵螨、植物花粉和動物蛋白等）刺激導致，是一種以Th2細胞因子優勢表達、IgE過度合成、嗜酸性粒細胞選擇性浸潤為特征的疾病。目前已知Th1/Th2的免疫失衡是AR發病的重要機制[18]。Th1通過激活巨噬細胞分泌γ干擾素、IL-2等Th1細胞因子來清除體內的各種致病因素，能增強宿主對眾多病原體感染的免疫防御能力；Th2主要通過促進抗體的產生、合成并分泌IL等因子、激活嗜酸性粒細胞等途徑產生免疫反應，Th2細胞與Th1細胞通過其產生的細胞因子而相互抑制、相互協調對方的功能而達到平衡[19]。有研究表明，過敏性疾病主要是Th2型過敏反應[19-20]。在AR的病理過程中，過敏原會誘導Th2細胞的增殖，使IL-4、IL-5、IL-10、IL-13的分泌增加，進而促進IgE產生、嗜酸性粒細胞浸潤和肥大細胞脫顆粒，最終加劇AR的發生和發展。

在本研究中，與空白對照組比較，模型組大鼠出現明顯的擦鼻、打噴嚏、流鼻涕和鼻腔紅腫出血等癥狀，鼻部癥狀評分顯著升高，血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平均顯著升高，鼻黏膜組織病理損傷明顯，鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達水平均顯著升高，表明模型組大鼠體內Th1/Th2處于非動態平衡的狀態。與模型組比較，復方魚鵝滴鼻劑能明顯改善模型大鼠擦鼻、打噴嚏、流鼻涕和鼻腔紅腫出血等癥狀，降低模型大鼠鼻部癥狀評分及血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平，改善模型大鼠鼻黏膜組織病理損傷，抑制鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達。這表明復方魚鵝滴鼻劑可能通過調節Th1/Th2平衡，對由炎癥因子和免疫細胞參與的變態反應性AR產生抑制作用。

綜上所述，復方魚鵝滴鼻劑能夠降低卵清蛋白誘導的AR模型大鼠血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平，抑制鼻黏膜組織中IL-2、IL-13、TNF-α的蛋白表達，減少鼻黏膜組織中嗜酸性粒細胞的浸潤，改善AR的癥狀，即通過調節Th1/Th2相關因子的平衡，緩解鼻部變應性炎癥反應，從而達到改善AR的目的。但由于影響Th1/Th2平衡的相關因子較多，后期可通過深入研究其他相關因子，為復方魚鵝滴鼻劑治療AR的作用機制提供佐證。