活血止痛膠囊/片中5種皂苷類成分含量測定及確證非法添加方法的建立Δ

陳潔，史達，曹玉，張玲1，#（1.南京醫科大學藥學院，南京 1111；.南京市食品藥品監督檢驗院，南京 11198）

活血止痛膠囊、活血止痛片均由當歸、三七、乳香（制）、冰片、土鱉蟲、煅自然銅6味藥材組成，具有活血散瘀、消腫止痛的功效，主治跌打損傷、瘀血腫痛，臨床多用于治療急慢性軟組織損傷類疾病[1]?，F行國家標準2020年版《中國藥典》（一部）（以下簡稱“藥典”）僅要求采用高效液相色譜（HPLC）法對活血止痛膠囊中三七藥材的質量標志性成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量進行測定，并對3種成分的總含量進行了限定[1]；而國家藥品標準YBZ25062005-2010Z并未對活血止痛片中上述標志性成分的含量進行限定[2]?？梢?，活血止痛膠囊/片的質控指標有限，其內在質量難以得到全面評價。

人參、西洋參、三七均為五加科人參屬植物，均以皂苷類化合物為主要活性成分，三者化學成分相近，且西洋參中人參皂苷Rb1和人參皂苷Re的含量遠高于三七[3]，若以西洋參投料則較易滿足藥典標準中皂苷總含量的相關規定。有報道指出，活血止痛膠囊/片等中藥復方制劑中可能存在人參、西洋參邊角料及三七莖葉非法添加的現象[4-7]。鑒于常規液相色譜方法靈敏度低、分離效果不佳，難以滿足復方制劑中非法添加的檢測要求，故建立統一的定量分析方法以同時檢測活血止痛膠囊/片中多種質量標志性皂苷類成分的含量并確證其非法添加現象，對全面控制制劑的質量具有重要意義。為此，本研究擬采用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLCMS/MS）法同時檢測活血止痛膠囊/片中三七指標性皂苷類成分三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re的含量，并通過檢測人參特征性指標成分人參皂苷Rf、三七莖葉特征性指標成分人參皂苷Rb3、西洋參特征性指標成分擬人參皂苷F11來確證上述制劑的非法添加現象[8-12]。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ACQUITY UPLC-HCLASS型超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S Micro型三重四極桿質譜儀（美國Waters公司），CPA225D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司），Milli-Q型純水儀（美國Merck Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

三七皂苷R1對照品（批號110745-201921，純度90.4%）、人參皂苷Rg1對照品（批號110703-202034，純度94.0%）、人參皂苷Rb1對照品（批號110704-202028，純度93.1%）、人參皂苷Re對照品（批號110754-202129，純度96.0%）、人參皂苷Rd對照品（批號111818-202104，純度97.3%）、人參皂苷Rf對照品（批號111719-201806，供鑒別用）、人參皂苷Rb3對照品（批號111686-202005，純度96.5%）、擬人參皂苷F11對照品（批號110841-200404，純度99.5%）、三七對照藥材（批號120941-201409）、人參對照藥材（批號120917-201712）、西洋參對照藥材（批號120997-201810）、三七莖葉皂苷對照提取物（批號110871-202102）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，正丁醇等其余試劑均為分析純，水為超純水。

活血止痛膠囊/片均為市售產品，分別購自南京中山制藥有限公司、珠海安生鳳凰制藥有限公司、江西百神昌諾藥業股份有限公司等6家企業，共計40個批次，具體來源信息見表1。

表1 活血止痛膠囊/片的來源信息

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

以Agilent RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）為色譜柱，以水（含0.1%甲酸）為流動相A、乙腈為流動相B進行梯度洗脫（0～10 min，80%A→70%A；10～15 min，70%A→40%A；15～15.5 min，40%A→80%A；15.5→20 min，80%A）；流速為0.35 mL/min；柱溫為35℃；進樣量為2 μL。

離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），采用多反應監測（multi-reaction monitoring，MRM）模式進行負離子掃描；毛細管電壓為3 500 V；脫溶劑氣為氮氣，脫溶劑氣溫度為500℃。8種待測皂苷類成分的質譜檢測參數見表2。

表2 8種待測皂苷類成分的質譜檢測參數

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液和三七莖葉提取物對照溶液 取三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11對照品各約10 mg，精密稱定，分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，制得上述8種成分質量濃度分別為1.065、1.068、1.069、1.147、1.017、1.053、1.120、1.336 mg/mL的對照品儲備液。另取三七莖葉皂苷對照提取物適量，同法制得質量濃度為1.216 mg/mL（以提取物質量計）的三七莖葉提取物對照溶液。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密吸取“2.2.1”項下三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11對照品儲備液適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，用20%乙腈稀釋至刻度，混勻，制得各成分質量濃度分別為149.95、149.95、150.08、150.02、149.91、149.95、150.08、149.90 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取活血止痛膠囊內容物約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，加熱回流2.5 h，放冷，再次稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，以10 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL至10 mL量瓶中，用20%乙腈定容，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。取活血止痛片樣品，研磨成粉，同法操作。

2.2.4 對照藥材溶液 取西洋參、人參、三七對照藥材各約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，照“2.2.3”項下方法操作，制得各對照藥材溶液。

2.2.5 空白溶液 取80%甲醇適量，作為空白溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各適量，按照“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄總離子流圖（圖1A～圖1B，片劑和空白溶液的色譜圖略）。由圖1可知，各成分色譜峰峰形良好，空白溶液對各成分的測定無干擾。

在參考相關文獻的基礎上[8-12]，本研究通過比對含擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf混合對照品和各對照藥材、三七莖葉提取物對照溶液的總離子流圖（圖1A和圖1C～圖1F）可知，三七中含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd；擬人參皂苷F11為西洋參特有成分，人參皂苷Rb3為三七莖葉特有成分，人參皂苷Rf為人參特有成分，三七藥材中基本不含有以上3種成分，故前述5種成分可作為三七質量評價的考察指標。

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液1 mL，用20%乙腈逐級稀釋，制成不同質量濃度（含8個濃度點）的混合對照品標準工作溶液，按照“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的質量濃度為橫坐標（X）、對應峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。結果顯示，各待測成分在各自的檢測質量濃度范圍內與峰面積成良好的線性關系（R2＞0.997），詳見表3。

表3 8種待測皂苷類成分的回歸方程、線性范圍和檢測限、定量限

2.3.3 檢出限與定量限考察 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液，用20%乙腈逐級稀釋，按照“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，以信噪比3∶1計算檢出限，以信噪比10∶1計算定量限，結果見表3。

2.3.4 精密度試驗 按照“2.3.2”項下方法制備三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11質量濃度分別為19.99、19.99、20.01、20.00、19.98、19.99、20.01、19.99 ng/mL的另一混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜與質譜條件連續進樣分析6次，記錄峰面積。結果顯示，上述成分峰面積的RSD分別為3.52%、4.32%、4.06%、3.47%、3.16%、4.57%、5.40%、4.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一活血止痛制劑樣品（膠囊：批號190328；片劑：批號201004），精密稱定，各平行6份，分別加入人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11對照品儲備液89.2、95.0、74.8 μL，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果顯示，膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11含量的RSD分別為2.69%、2.22%、2.86%、2.89%、4.81%、1.09%、1.17%、1.83%（n＝6），片劑中上述成分含量的RSD分別為2.91%、2.17%、3.04%、2.67%、3.58%、1.24%、1.32%、1.56%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.6 穩定性試驗 取“2.3.5”項下同一供試品溶液（膠囊：批號190328），分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按照“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果顯示，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11峰面積的RSD均不高于4.79%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的活血止痛膠囊（批號190328）、活血止痛片（批號201004）樣品適量，各平行6份，分別精密加入與活血止痛膠囊已知量相當的三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd對照品儲備液28.2、93.6、117.0、14.2、21.8 μL，或者與活血止痛片已知量相當的上述各對照品儲備液24.4、88.2、105.0、12.4、28.0 μL，同時加入人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11對照品儲備液89.2、95.0、74.8 μL。按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11的平均加樣回收率分別為 101.71%、102.40%、100.40%、101.37%、98.72%、100.00%、98.98%、98.84%，RSD分別為4.64%、3.52%、4.30%、4.21%、3.23%、1.17%、1.09%、1.83%（n＝6）；片劑中上述成分的平均加樣回收率分別為106.47%、106.10%、100.17%、102.39%、95.18%、96.22%、99.98%、98.92%，RSD 分 別 為 4.29%、3.58%、3.86%、2.81%、4.04%、2.15%、1.29%、1.71%（n＝6）。

2.3.8 樣品含量測定 取不同批次的活血止痛膠囊和活血止痛片，按照“2.2.3”項下方法平行制備供試品溶液各2份，按照“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積，再按標準曲線法計算樣品中各皂苷類成分的含量并進行人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11的確證分析。不同廠家樣品的具體檢測結果見表4。

表4 不同廠家活血止痛膠囊/片中8種皂苷類成分的含量測定結果（n＝2，μg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑與提取方式考察

本課題組前期考察了不同體積分數（70%、80%、100%）甲醇以及水飽和正丁醇對活血止痛制劑中皂苷類成分的提取效果，同時考察了加熱回流提取和超聲提取對皂苷類成分提取率的影響，結果表明，80%甲醇加熱回流提取的效果最優，經提取時間（1.5、2、2.5、3 h）優化后，最終確定選用80%甲醇加熱回流提取2.5 h。

3.2 色譜與質譜條件優化

本課題組前期對水-甲醇、水-乙腈等流動相的組成進行了考察，結果表明，水-乙腈流動相體系的分離效果優于水-甲醇體系；同時，在水相中加入0.1%甲酸可提高各待測成分的色譜響應值，改善其色譜峰峰形，提高離子化效率。本課題組前期對不同皂苷類成分對照品溶液進行了質譜分析，在調節錐孔電壓和碰撞能量的同時優化了待測成分的定量離子對，結果表明，在MRM、ESI負離子掃描模式下，各待測成分的分子離子峰均較穩定且響應較強。

3.3 檢測方法的選擇

HPLC法雖在皂苷類成分的檢測中運用廣泛[13]，但該類成分的紫外響應較弱，且擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb3等分子內并無共軛體系，僅在紫外檢測器中呈末端吸收；而蒸發光散射檢測器存在靈敏度低、專屬性有限的不足[14]。由此可見，將常規HPLC法作為非法添加指標性成分的篩查手段，存在檢測靈敏度和選擇性不高的缺點。UPLC-MS/MS法具有檢測靈敏度高、選擇性強、假陽性少等優點[15]，故本研究選擇該法快速檢測活血止痛膠囊/片中的皂苷類指標性成分。

3.4 含量檢測結果分析

本研究從各批次活血止痛膠囊/片中均檢出人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、三七皂苷R1，其中膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1總含量均符合藥典的含量限度要求[1]。有研究表明，西洋參、人參、三七共有峰峰面積比值存在一定關系：在西洋參、人參、三七中，人參皂苷Rg1與人參皂苷Re比值分別為0.13±0.08、1.20±0.60、8.30±3.00[16]。本課題組根據皂苷峰面積比值關系并結合特征性指標成分對活血止痛制劑中的三七藥材質量進行了評價分析，結果顯示，制劑中人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的峰面積比值為7.79～8.62，與文獻[16]基本一致。各批產品中均未檢出人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11，部分樣品檢出了人參皂苷Rb3，經與三七對照藥材溶液（未經稀釋）及人參皂苷Rb3對照品溶液色譜圖對比，初步判斷人參皂苷Rb3可能與三七藥材有關；所測批次樣本中均未發現西洋參、人參非法添加現象。此外本研究還發現，按照片劑規格及日服用量等量折算，江西桔王藥業有限公司的活血止痛片中5種皂苷類成分的含量普遍低于其他生產廠家樣品，考慮可能存在三七投料量偏低的現象。

綜上所述，本文以UPLC-MS/MS法為手段，建立了同時測定活血止痛膠囊/片中5種指標性皂苷類成分含量和確證西洋參、人參、三七莖葉非法添加的檢測方法，可為活血止痛制劑的質量控制提供參考，為打擊非法添加行為提供技術支撐。