雙醋瑞因膠囊在健康受試者中的餐后生物等效性研究Δ

徐鳳華，黃明（1.南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院藥學部，江蘇 蘇州 215153；2.蘇州大學附屬第二醫院臨床藥理實驗室，江蘇 蘇州 215151）

雙醋瑞因膠囊原研制劑（商品名安必丁?）由阿根廷TRB Pharma S.A.公司研發，是骨關節炎白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）的主要抑制劑，用于髖、膝關節等骨關節炎的臨床治療[1]。有研究指出，該藥對骨關節炎患者的關節功能具有顯著的保護作用，可通過減輕疼痛、延緩病程來提高患者的生活質量，且較非甾體抗炎藥有更強的后續效應和更高的安全性[1-2]。

藥動學研究和仿制藥一致性評價均需要測定藥物的藥動學參數，故準確檢測生物樣品中的藥物濃度顯得非常重要。按照我國藥品注冊管理要求，仿制藥注冊需在健康人體中進行生物等效性研究[3]。目前，雙醋瑞因膠囊仿制藥在中國健康受試者空腹狀態下的藥動學數據已有報道[4]。參考上述研究，結合原研制劑說明書推薦（雙醋瑞因宜餐后服用），本研究擬采用甲醇沉淀蛋白預處理血漿樣品，使用液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法測定人血漿中雙醋瑞因活性代謝產物大黃酸的濃度；同時，擬初步評價雙醋瑞因膠囊原研制劑（參比制劑）與國產仿制藥（受試制劑）在中國健康受試者體內的餐后生物等效性，以期為國產雙醋瑞因膠囊的上市及臨床應用提供參考依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Turboionspray?型電噴霧離子源、API4000型三重四極桿串聯質譜儀、Analyst 1.6數據采集軟件（美國AB Sciex公司），XS 105DU型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），Milli-Q Academic型純水機（美國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用受試制劑雙醋瑞因膠囊（批號T93-013，規格50 mg）由江蘇某制藥有限公司提供；參比制劑雙醋瑞因膠囊（商品名安必丁?，國藥準字HJ20150130，規格50 mg）由阿根廷TRB Pharma S.A.公司生產并由昆明積大制藥股份有限公司分裝。大黃酸對照品（批號110757-200206，純度100.0%）、大黃素對照品（內標，批號110756-200110，純度100.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇和甲酸均為色譜純，氫氧化鈉和醋酸銨均為分析純，水為超純水。

1.3 空白血漿

空白血漿來自本研究所納入的健康受試者，于其給藥前采集、處理所得。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse plus C8（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），保護柱為Phenomenex Security GuardTMC18（4 mm×3.0 mm）；流動相為甲醇（A）-含0.4%甲酸的5 mmoL/L醋酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～4.1 min，75%A；4.1～4.2 min，75%A→95%A；4.2～5.2 min，95%A；5.2～5.3 min，95%A→75%A；5.3～8.0 min，75%A）；流速為1 000 μL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；分析時間為8.0 min。

離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），采用多反應監測（multi-reaction monitoring，MRM）模式進行負離子掃描；霧化氣壓力為344 738 Pa，加熱輔助氣壓力為344 738 Pa；離子源溫度為550℃；電噴霧電壓為-3 500 V；大黃酸和內標的定量離子對分別為m/z283.0→238.8、m/z268.9→224.8，去簇電壓分別為-50、-125 V，射入電壓分別為-3、-10 V，碰撞電壓分別為-35、-50 V，碰撞室射出電壓均為-5 V。

2.2 大黃酸和內標相關溶液的配制

2.2.1 大黃酸貯備溶液及工作溶液 稱取大黃酸對照品10.00 mg，轉移至10 mL量瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液20 μL，再用甲醇定容，混勻，得質量濃度為1.0 mg/mL的大黃酸標準曲線貯備溶液。取上述貯備溶液適量，用甲醇稀釋，得質量濃度分別為200.0、100.0、40.00、20.00、10.00、4.000、2.000、0.600 0 μg/mL 的大黃酸標準曲線工作溶液，160.0、16.00、1.600 μg/mL的大黃酸質控工作溶液和0.600 0 μg/mL的大黃酸定量下限工作溶液。

2.2.2 內標貯備溶液及工作溶液 稱取內標對照品10.00 mg，轉移至10 mL量瓶中，用甲醇定容，混勻，得質量濃度為1.0 mg/mL的內標貯備溶液。取上述貯備溶液適量，用甲醇稀釋，得質量濃度為0.500 0 μg/mL的內標工作溶液。

2.3 大黃酸校正標樣和質控血漿樣品的配制及處理

精密吸取空白血漿200 μL，轉移至1.5 mL離心管中，加入大黃酸標準曲線、質控工作溶液或定量下限工作溶液10 μL和內標工作溶液50 μL，再加入蛋白沉淀劑（甲醇）600 μL，振蕩混勻約1 min，于4℃下以23 755×g離心10 min。向潔凈進樣瓶中加入稀釋劑（水）600 μL，再加入上述離心后的上清液300 μL，混勻，備測。

2.4 受試者待測血漿樣品的處理

精密吸取受試者待測血漿樣品200 μL，轉移至1.5 mL離心管中，加入甲醇10 μL（用于體積補償）和內標工作溶液50 μL，其余步驟按“2.3”項下方法操作，備測。

2.5 選擇性試驗

分別取空白血漿200 μL按“2.3”項下方法處理（不加內標）后所得樣品、空白血漿200 μL與大黃酸標準曲線工作溶液（20.00 μg/mL）10 μL混勻后按“2.3”項下方法處理所得樣品、某受試者餐后口服雙醋瑞因膠囊（參比制劑）50 mg后1.0 h的血漿樣品按“2.4”項下方法處理所得樣品適量，按“2.1”項下條件進樣分析，記錄色譜圖（圖1，空白血漿樣品圖略）。結果顯示，大黃酸、內標的保留時間分別約為2.4、3.6 min，內源性物質不干擾大黃酸和內標的測定。

圖1 大黃酸定量分析的典型MRM圖

2.6 標準曲線繪制和定量下限考察

按“2.3”項下方法制得大黃酸質量濃度分別為30.00、100.0、200.0、500.0、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/mL的校正標樣并進行處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積。以待測物質量濃度為橫坐標（c）、待測物與內標的峰面積比值為縱坐標（y），采用最小二乘法（權重系數為1/c2）進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.001 4c+0.012 5（r＝0.999 4），大黃酸檢測質量濃度的線性范圍為30.00～10 000ng/mL，定量下限為30.00ng/mL。

2.7 殘留試驗

取3個空白血漿樣品和“2.6”項下最高質量濃度校正標樣（10 000 ng/mL）進行殘留試驗。在檢測最高質量濃度校正標樣后連續檢測3個空白血漿樣品，記錄峰面積。結果顯示，3個空白血漿樣品中大黃酸和內標的峰面積均為0，提示殘留效應在可接受范圍內，不影響待測物的檢測[5]。

2.8 精密度與準確度試驗

按“2.3”項下方法制得大黃酸質量濃度為30.00 ng/mL的定量下限質控血漿樣品和80.00、800.0、8 000 ng/mL的低、中、高質量濃度質控血漿樣品。在至少2 d內，使用3個獨立分析批、4個質量濃度的質控血漿樣品（每質量濃度平行6份）來評估批內、批間精密度（以RSD表示）和準確度（以RE表示），結果見表1。

表1 大黃酸定量分析的精密度與準確度試驗結果（n＝6）

2.9 提取回收率試驗

按“2.3”項下方法制得大黃酸質量濃度分別為80.00、800.0、8 000 ng/mL的低、中、高質量濃度質控血漿樣品（每質量濃度平行6份）并進行處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，得大黃酸和內標的峰面積（A1、A2）。精密吸取空白血漿200 μL，按“2.3”項下方法處理后，取上清液，加入大黃酸質控工作溶液，使其質量濃度與低、中、高質量濃度對應（每質量濃度平行6份），再按“2.1”項下條件進樣分析，得大黃酸和內標的峰面積（A3、A4）。分別以A1/A3×100%、A2/A4×100%計算大黃酸和內標的提取回收率，結果見表2。

表2 大黃酸定量分析的提取回收率與基質效應試驗結果（n＝6）

2.10 基質效應試驗

精密吸取6個不同來源的空白血漿200 μL，分別置于1.5 mL離心管中，加入蛋白沉淀試劑（甲醇）600 μL，振蕩混勻約1 min，于2～8℃下以23 755×g離心10 min，取上清液，即得血漿基質樣品。精密吸取水200 μL，置于1.5 mL離心管中，按上述方法處理，得純溶液非基質樣品。取血漿基質樣品或純溶液非基質樣品200 μL，加入大黃酸質控工作溶液10 μL和內標工作溶液50 μL，混勻，即得低、中、高質量濃度樣品溶液（每質量濃度平行6份）。取上述溶液300 μL，加入稀釋劑（水）600 μL，混勻后，分別按“2.1”項下條件進樣分析，記錄大黃酸峰面積（B血漿基質、B非基質）和內標峰面積（C血漿基質、C非基質），分別以B血漿基質/B非基質×100%、C血漿基質/C非基質×100%計算大黃酸和內標的基質因子，結果見表2。以大黃酸基質因子除以內標基質因子，計算得低、中、高質量濃度樣品溶液中大黃酸的平均內標歸一化基質因子分別為96.2%、94.7%、92.4%。

2.11 穩定性試驗

將80.00、800.0、8 000 ng/mL的低、中、高質量濃度質控血漿樣品（每質量濃度平行3份）在室溫白光下放置24 h、-20℃下儲存49 d和反復凍融（-20℃～室溫）循環3次后，再按“2.3”項下方法處理，測得各樣品實測質量濃度與理論質量濃度的RE均在±10.0%以內，提示質控血漿樣品在上述條件下放置的穩定性較好。將低、中、高質量濃度質控血漿樣品按“2.3”項下方法處理后，在自動進樣器（4℃）中放置23 h或在室溫白光下放置24 h，測得各樣品實測質量濃度與理論質量濃度的RE均在±10.0%以內，提示經處理的質控血漿樣品在上述條件下放置的穩定性較好。將大黃酸和內標貯備溶液（質量濃度均為1.0 mg/mL）在室溫白光下放置24 h或冷藏（2～8℃）保存47 d，測得各溶液實測質量濃度與理論質量濃度的RE均在±10.0%以內，提示各貯備溶液在上述條件下放置的穩定性較好。

2.12 兩種制劑生物等效性評價

2.12.1 研究對象 本研究方案經蘇州大學附屬第二醫院醫學倫理委員會審核批準[倫理批件號為（2014）倫審第（22）號]。受試者入選標準包括：＞18周歲，體質量指數（BMI）為19.0～26.0 kg/m2，試驗前14 d病史、生命體征、體格檢查，實驗室檢查及篩選期其他相關檢查均正常或未見有臨床意義的異常。排除標準包括：過敏體質或有藥物、食物過敏史者；篩選前12個月內有嗜煙（每天吸煙數量≥5支）史者；篩選前12個月內有藥物濫用史或成癮性物質檢測陽性者；篩選前3個月內接受過手術（特別是會影響藥物吸收、分布、代謝、排泄的手術）或者計劃在試驗期間進行手術者；篩選前14 d內有處方藥、非處方藥、中草藥、保健品服用史者。按上述標準，本研究最終納入健康受試者24名。所有受試者均簽署知情同意書，年齡為（24±3）歲，身高為（1.70±0.06）m，體質量為（61.9±6.9）kg，BMI符合上述標準。

2.12.2 試驗設計 本研究采用隨機、開放、雙周期交叉試驗設計：將24名受試者隨機分成2組（每組12名），禁食過夜10 h后，于每周期試驗首日早晨進食標準餐30 min后，分別口服受試制劑或參比制劑50 mg（用溫開水240 mL送服）。受試者兩周期服藥順序由隨機結果決定，清洗期為1周。分別于服藥前以及服藥后20、40 min和1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10、12、15、24 h時于肘靜脈取血3 mL，置于肝素鈉采血管中，于4℃下以2 304×g離心5 min，分離上層血漿，將血漿分成2份（1份用于檢測，1份用于備份），于-20℃下凍存。本研究所用標準餐食譜符合餐后生物等效性研究設計中對高脂高熱量食譜的要求[6]。

2.12.3 生物等效性評價 24名受試者均完成試驗。取其凍存的血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積，以隨行標準曲線計算血漿樣品中大黃酸的質量濃度。結果顯示，受試者血漿樣品中大黃酸的質量濃度為35～7 305 ng/mL，均在線性范圍內。采用DAS 3.2.9軟件繪制平均血藥濃度-時間曲線并計算主要藥動學參數。藥動學參數包括血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-24h、AUC0-∞）、峰濃度（cmax）、達峰時間（tmax）、半衰期（t1/2）。其中，cmax和tmax均以實測值表示；AUC0-24h用梯形法計算；AUC0-∞和t1/2分別按下式計算：AUC0-∞＝AUC0-24h+ct/λz，t1/2＝0.693/λz（式中，ct為最后1個時間點的血藥濃度；λz為末端消除速率常數，以對數血藥濃度-時間曲線末端直線部分的斜率求得）。24名受試者餐后口服受試制劑和參比制劑50 mg后，大黃酸的平均血藥濃度-時間曲線見圖2，主要藥動學參數見表3。

圖2 受試者餐后口服受試制劑和參比制劑50 mg后大黃酸的平均血藥濃度-時間曲線（n＝24）

表3 受試者餐后口服受試制劑和參比制劑50 mg后大黃酸的主要藥動學參數（±s，n＝24）

表3 受試者餐后口服受試制劑和參比制劑50 mg后大黃酸的主要藥動學參數（±s，n＝24）

a：tmax以“中位數（最小值，最大值）”表示

制劑受試制劑參比制劑t1/2/h 4.26±1.12 4.19±1.05 AUC0-24 h/（ng·h/mL）25764±6134 24316±5856 AUC0-∞/（ng·h/mL）26679±6409 25170±6415 cmax/（ng/mL）3517±1121 3225±755 tmaxa/h 3.50（0.67，12.00）4.00（1.50，7.00）

本研究對受試者餐后狀態下的主要藥動學參數（cmax、AUC0-24h、AUC0-∞）進行自然對數轉換，然后以多因素方差分析進行顯著性檢驗，用雙向單側t檢驗及90%置信區間來評價受試制劑與參比制劑的生物等效性。若經對數轉換后受試制劑和參比制劑cmax、AUC0-24h、AUC0-∞幾何均值比的90%置信區間落在接受范圍（80.00%～125.00%）之內，則表示兩制劑生物等效[5]。對tmax進行配對秩和檢驗。采用DAS 3.2.9軟件進行上述統計分析，檢驗水準α＝0.05。

方差分析模型中，以序列、藥物、周期為固定效應，受試者（序列）為隨機效應，計算主要藥動學參數幾何均值比（受試制劑/參比制劑）的90%置信區間。結果顯示，兩制劑cmax、AUC0-24h、AUC0-∞幾何均值比的90%置信區間分別為 100.8%～113.9%、103.1%～109.4%、103.2%～109.9%，相對生物利用度（受試制劑與參比制劑AUC0-24h之比）為（106.6±8.9）%。由此可判定，在餐后狀態下，兩制劑生物等效。此外，受試制劑的tmax與參比制劑比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

在試驗過程中，所有受試者均未見明顯不良事件發生。相關檢測結果顯示，24名受試者血常規、尿常規等檢測值異常發生率低，且異常并無臨床意義；同時，未見有臨床意義的心電圖變化，其收縮壓、舒張壓、脈搏、體溫均在正常范圍內波動。

3 討論

血漿中大黃酸濃度的測定方法包括高效液相色譜-紫外光譜（HPLC-UV）法[7-8]和 HPLC-MS/MS 法[4，9-10]。近年來，血漿大黃酸濃度的測定以靈敏度更高、專屬性更強的HPLC-MS/MS法為主。本研究樣本量較大，甲醇直接沉淀蛋白法具有簡便、快捷的優點[11]，可滿足雙醋瑞因膠囊藥動學研究的大樣本檢測。因此，本研究采用甲醇沉淀蛋白進行血漿樣品前處理，定量下限為30.00 ng/mL，低于文獻所示結果[4]。

在血藥濃度測定方面，本課題組對液相條件進行了優化：在水相中加入醋酸銨，有利于大黃酸和內標色譜峰峰形的改善。雖然有研究指出，在負離子掃描模式下，若在水相中加入酸性物質（如甲酸），理論上會減弱大黃酸的色譜響應[12]。但本課題組前期考察結果顯示，在水相中加入少量甲酸有利于大黃酸和內標色譜峰峰形的進一步改善，且不會影響大黃酸的定量下限；同時，當在水相中加入0.4%的甲酸時，大黃酸色譜峰的響應較強且保留時間適中。此外，筆者在檢測方法建立的過程中發現，在等度洗脫條件下連續分析多個樣品后，大黃酸的質譜響應波動明顯且有減弱趨勢，分析原因可能與蛋白沉淀所得血漿樣品中內源性雜質較多有關，遂在保證試驗效率的基礎上，采取如下措施：（1）在沉淀蛋白后，取上清液300 μL并加水600 μL稀釋，混勻后再進樣分析，有助于減少基質效應的干擾并降低液質聯用儀、色譜柱被污染的可能性；（2）將流動相洗脫方式優化為梯度洗脫，即先用75%甲醇等度洗脫，使大黃酸及內標出峰；再用95%甲醇洗脫，洗去內源性雜質以減少對后續樣品檢測的影響。

本研究報道了餐后狀態下中國健康受試者口服雙醋瑞因膠囊后主要代謝產物大黃酸的藥動學數據。Mandawgade等[13]報道，印度健康志愿者餐后口服雙醋瑞因膠囊50 mg，其體內大黃酸的AUC0-∞、cmax、tmax分別為26 578.63 ng·h/mL、4 298.63 ng/mL、5 h；Nicolas等[14]報道，法國健康志愿者餐后口服雙醋瑞因膠囊50 mg后，其體內大黃酸的AUC0-∞為25 900 ng·h/mL，tmax為5.2 h。本研究所得受試制劑和參比制劑的主要藥動學參數AUC0-∞、tmax與上述文獻接近，但cmax與Mandawgade等[13]的結果有所差異，這可能與樣本量和受試者人群不同有關。本研究結果顯示，受試制劑（國產雙醋瑞因膠囊）和參比制劑（安必丁?）生物等效。

綜上所述，在受試者餐后狀態下，受試制劑和參比制劑生物等效。本研究采用甲醇沉淀蛋白預處理血漿樣品，使用HPLC-MS/MS法測定了中國健康受試者餐后口服雙醋瑞因膠囊后血漿中活性代謝產物大黃酸的濃度，計算了該成分的主要藥動學數據，并評價了受試制劑與參比制劑的生物等效性，為國產雙醋瑞因膠囊上市及臨床應用提供了參考依據。