發病盔形溞沃氏葡萄球菌的分離與鑒定

曹雅芹，戚惠穎，徐大勇，趙雅潔，顧東萍，黃金飛，鄧道貴

(淮北師范大學生命科學學院，安徽淮北 235000)

溞屬種類是一類常見的淡水枝角類甲殼動物，它們既濾食水體中的浮游藻類、有機碎屑和細菌；又因其具有繁殖率高、營養豐富、易培養、運動緩慢等特點，又是魚類的天然餌料，它們是水生生態系統食物鏈的重要組成部分。幾丁質是自然界中十分豐富的合成聚合物，廣泛存在于昆蟲外骨骼、甲殼動物的外殼(包括溞屬種類的殼刺)、真菌細胞壁等生物體中，主要對生物體起保護作用。目前，已有研究者對蝦蟹類的幾丁質及幾丁質衍生物的特性開展了研究。另有研究表明，從蝦、蟹和真菌中提取的幾丁質具有抗菌活性。

葡萄球菌是一種革蘭氏陽性的球形細菌，廣泛分布于自然界、人與動物的皮膚和黏膜上，通常排列成葡萄串狀。VON EIFF等認為，葡萄球菌屬中的一些種類(包括沃氏葡萄球菌)是一類新的致病菌。沃氏葡萄球菌的毒性弱于金黃色葡萄球菌，通?？梢栽谌梭w表面、動物和發酵食品中檢測到。葡萄球菌屬種類不僅廣泛分布在熱帶海水、沉積物、藻類和無脊椎動物中，也被發現在亞熱帶海洋魚類和淡水魚類中。目前，有關沃氏葡萄球菌侵染魚類、引起致病的研究已有一些報道。

在自然水體中，溞屬種類殼刺斷裂的現象十分普遍，但其發生機理尚不清楚。本文利用平板分離技術，以16S rDNA基因作為分子標記，對發病盔形溞進行了病原分離與鑒定，旨在為溞屬種類殼刺斷裂的病原機理提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和培養基

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，Taq Plus DNA聚合酶，GeneRuler DNA Ladder Mix，幾丁質等均購自生物工程(上海)股份有限公司。

LB固體培養基：胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH 7.0；LB液體培養基不加瓊脂粉。

膠體幾丁質液體發酵培養基：0.03% KHPO，0.07% KHPO，0.002% FeSO，0.05% MgSO·7HO，0.001% ZnSO，1.5% 膠體幾丁質，pH 7.0。

膠體幾丁質固體篩選培養基：液體培養基基礎上添加1.6%瓊脂。膠體幾丁質的制備參考苗飛等的方法。

1.2 引物

16S rDNA引物為細菌性檢測通用引物27F和1492R，即27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 盔形溞的培養及鳙魚水的配制

盔形溞()來自巢湖休眠卵的孵化。孵出的盔形溞幼溞投喂斜生四鏈藻()，在溫度(25±1)℃、光暗比為12 h∶12 h、光照度為2 500 lx的條件下培養，成熟后產出的第三代幼溞(出生<6 h)用于實驗。

鳙魚水配制：從魚塘中購買新鮮的鳙魚(約1 kg)放養在水缸中，注入15 L的曝氣48 h以上的自來水，2 d后收集鳙魚水，用0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾，-20 ℃冰箱保存備用。

1.4 發病盔形溞的來源

發病盔形溞來自本實驗室，盔形溞()在鳙魚水培養下出現殼刺斷裂的現象。實驗時，將第三代盔形溞幼溞(出生<6 h)分成試驗組與對照組，每組15只。試驗組每只分別放入50 mL的燒杯中，加入40 mL的培養液(含有20%鳙魚水和80%曝氣自來水)，對照組分別加入40 mL 100%曝氣自來水。實驗期間，在Olympus CX21顯微鏡下觀察盔形溞的殼刺形態變化。

1.5 發病盔形溞的細菌菌株分離及形態觀察

收集實驗期間出現殼刺斷裂現象的盔形溞(圖1)，先用無菌解剖刀切取殼刺，使用無菌水沖洗幾遍，再用無菌槍頭搗碎后接種于LB液體培養基，37 ℃下震蕩培養4～5 h。取少許菌液，采用涂布法均勻涂布到LB平板。挑選單菌落，并進行純化，經純化后的細菌再接種到膠體幾丁質固體培養基上觀察是否有菌落產生。

圖1 魚水培養引發的盔形溞殼刺斷裂現象Fig.1 Broken tail spine of D.galeata under fish-water culture圖A、B是魚水培養下引發的盔形溞殼刺斷裂的現象，圖C是正?？螠械臍ご?/p>

用接種環隨機挑取9個單菌落并分離純化，對純化后的菌株進行涂片，革蘭氏染色，在Olympus CX21 顯微鏡下觀察細菌形態。

1.6 分離菌株的16S rDNA擴增及系統進化樹的構建

按照潘曉磊等的方法，以分離菌株的DNA作為模板，采用細菌16S rDNA基因通用引物27F和1492R，對目標菌株進行PCR擴增。采用25 μL PCR反應體系：10×PCR Buffer、dNTP(each 10 mmol/L)、Taq Plus DNA Polymerase(5 U/μL)、50 mmol/L MgSO共計12.5 μL，上、下游引物各1 μL，Template(DNA) 1 μL，ddHO 9.5 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，30 個循環；72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min。對PCR擴增產物進行純化，由生物工程(上海)股份有限公司完成測序。

將9個分離菌株16S rDNA測序結果拼接后，通過NCBI/BLAST進行序列比對，使用MEGA 7.0軟件，用Neighbour-Joining法構建系統進化樹，確定其屬種。

然后，將純化的菌株在液體LB培養基37 ℃下震蕩培養10～12 h，使用稀釋涂布平板法計算菌液濃度，用于分離菌株的致病性試驗。菌種和50%甘油按照1∶1的比例保存于-80 ℃。

1.7 分離菌株致病性試驗

將沒有受到鳙魚水侵染的第三代盔形溞幼溞(出生<6 h)設置試驗組與對照組。試驗組與對照組分別設3個平行，每個平行5個盔形溞，每個平行的盔形溞均放入含100 mL無菌蒸餾水的150 mL錐形瓶中。每個平行盔形溞的錐形瓶中接種菌液濃度為9.2×10CFU/mL，在25 ℃下智能光照震蕩培養箱中培養，轉速為40 r/min 。在Olympus CX21顯微鏡下觀察分離菌株對盔形溞的致病性。

當分離菌株侵染正常盔形溞致病后，取病灶(盔形溞斷裂的殼刺)進行分離純化細菌，16S rDNA分子標記測序，檢驗此菌株與原分離菌株是否一致。

2 結果

2.1 分離菌株的形態特征

純化后的分離菌株在膠體幾丁質培養基中培養，均出現濕潤、表面光滑、隆起的乳白色圓形小菌落(圖 2A)。挑取單個菌落涂片進行革蘭氏染色鏡檢，結果均顯示革蘭氏染色陽性，顯微鏡下可見菌體呈藍紫色，單個、成對、短鏈狀或者不規則排列聚集呈葡萄串狀分布的革蘭氏陽性球菌(圖 2B)。

圖2 分離菌在膠體幾丁質培養基平板(A)和顯微鏡(B)下的形態Fig.2 Morphology of isolated bacteria on colloidal chitin medium plate(A) and under oil microscope(B)

2.2 分離菌株遺傳距離分析及系統進化樹的構建

9個分離菌株16S rDNA擴增產物測序所得的核苷酸序列，與NCBI上登錄的不同來源8株沃氏葡萄球菌的遺傳距離最小，范圍在0～0.001(圖3)。利用MEGA 7.0軟件構建Neighbour-Joining進化樹，結果顯示，1～9株分離菌株與8株沃氏葡萄球菌的親緣關系最近，位于同一個小分支上(圖4)。因此，9株分離菌均應為沃氏葡萄球菌。

圖3 分離菌株遺傳距離分析結果Fig.3 Results of genetic distance analysis on isolated bacteria1～9是本研究的分離菌株，其它12株是NCBI上登錄的不同來源的葡萄球菌

圖4 分離菌株系統進化樹的構建Fig.4 Construction of phylogenetic tree of isolated bacteria

2.3 分離菌株致病性試驗結果

在致病性試驗過程中，試驗組盔形溞幼溞接種分離菌株菌液4 d后，3個平行試驗組分別有80%、80%、60%的盔形溞出現殼刺斷裂的癥狀(圖5)。用膠體幾丁質培養基平板對試驗組斷裂殼刺進行細菌菌株分離，結果也分離培養出濕潤、表面光滑、隆起的乳白色圓形小菌落，呈革蘭氏染色陽性球菌，在顯微油鏡下菌體特征與鳙魚水培養引起的盔形溞斷裂殼刺中分離到的菌株一致。對照組盔形溞，未能從其殼刺中分離到該細菌。

圖5 沃氏葡萄球菌侵染盔形溞后殼刺的變化Fig.5 Changes of the tail spine of D.galeata infected by S.warneriA是分離菌株引發的盔形溞殼刺斷裂現象，B是A的放大圖

2.3 致病性試驗后盔形溞斷裂殼刺中分離菌的鑒定

將致病性試驗后盔形溞斷裂殼刺中得到的10～13株分離菌16S rDNA測序結果，在NCBI里進行BLAST，用MEGA 7.0軟件構建Neighbour-Joining進化樹，結果顯示，10～13株分離菌株與1～9株分離菌和沃氏葡萄球菌的親緣關系最近，位于同一個小分支上(圖6)。因此，10～13株分離菌也均為沃氏葡萄球菌。

圖6 致病試驗后盔形溞斷裂殼刺中分離菌株系統進化樹的構建Fig.6 Phylogenetic tree construction of isolated bacteria from broken tail spines of D.galeata after pathogenic test10～13株是致病性試驗后斷裂殼刺中的分離菌

3 討論

本研究結果表明，鳙魚培養水引起盔形溞殼刺斷裂的主要原因是由沃氏葡萄球菌致病造成的。該菌也曾在羅非魚()、虹鱒()和黃帶擬鲹()等多種魚類中被發現，被認為是魚類病害的潛在病原。本研究從盔形溞斷裂殼刺中分離鑒定出沃氏葡萄球菌，該菌是否與鳙魚生活環境或者鳙魚自身的生理需求有關，目前尚不清楚。此外，沃氏葡萄球菌侵染盔形溞的致病部位是否只位于殼刺，還有待于進一步研究。

幾丁質普遍存在于陸地和水生生態系統中，是一種十分豐富的有機大分子多聚物。幾丁質的降解過程需要有幾丁質酶的參與。目前，變形菌門中的粘質沙雷氏菌()、假交替單胞菌(sp)和纖維弧菌()，放線菌門中的鏈霉菌(sp)等多種幾丁質降解菌已相繼被發現。此外，在厚壁菌門的蠟樣芽胞桿菌()、枯草芽胞桿菌()、蘇云金芽胞桿菌()、類芽胞桿菌()和沃氏葡萄球菌()等種類中發現了幾丁質酶的存在。ITOH等認為，產生幾丁質酶的細菌一般能夠參與幾丁質的降解。在甲殼動物的外殼中，幾丁質是廣泛存在的，且在這些動物的生長過程中須完成新舊外骨骼的更替。在全基因組測序結果中，SAMRITI等發現了沃氏葡萄球菌中幾丁質酶的存在。先前的研究已經表明，利用膠體幾丁質培養基能夠篩選出產生幾丁質酶的菌株。本研究中，沃氏葡萄球菌在幾丁質培養基平板上長出了乳白色菌落，這暗示沃氏葡萄球菌能夠產生幾丁質酶、且產生的幾丁質酶水解了培養基中的幾丁質。當沃氏葡萄球菌再次侵染健康的盔形溞后，會產生和鳙魚培養水引起盔形溞殼刺斷裂的相同性狀。因此，我們認為這可能是沃氏葡萄球菌產生的幾丁質酶對盔形溞殼刺中的幾丁質有水解作用。由于盔形溞殼刺部位含有較多的幾丁質，這可能是盔形溞殼刺部位易受到沃氏葡萄球菌侵染致病的原因。

根據科赫法則，沃氏葡萄球菌是造成本研究中盔形溞殼刺斷裂的重要原因，但也不能排除盔形溞個體遇到潛在威脅時通過調節外部形態特征和內部生理功能等來適應異質生境而產生形態上的變化。因此，我們認為有必要深入開展沃氏葡萄球菌侵染盔形溞的機制及可能產生的病害等方面的研究，以提高人們對沃氏葡萄球菌侵染水生甲殼類動物表層幾丁質的認識。