益生菌對Balb/C小鼠外周血CD3、CD4和CD8分子表達水平的影響

吳玉臣, 康靜靜, 張雪銘, 高 豐

（1.吉林大學, 吉林長春 130062； 2.河南牧業經濟學院, 河南鄭州 450046； 3.華南農業大學, 廣東廣州 510642）

益生菌是一種定植于宿主腸道內的活菌制劑, 適當攝入可以改善宿主微生態平衡, 對宿主健康產生有益影響。益生菌主要通過調節環境pH、競爭繁殖、抑制代謝產物、免疫激活等機制抑制病原菌的生長, 提高宿主免疫功能, 從而對胃腸道疾病起到明顯的防治作用（杜志琳等, 2016）。近年來, 益生菌制劑在我國防治疾病方面顯示出了良好的應用前景（孫雯娟等, 2015）, 但益生菌在動物機體中的具體作用機制有待進一步明確。

白細胞分化抗原（Cluster of Differentiation, CD）是細胞膜上的一類蛋白質或糖蛋白, 來自不同譜系的白細胞在不同階段的分化成熟和活化過程中出現細胞表面標記。CD編碼占據最多的是細胞因子和趨化性細胞因子及其受體、黏附分子和協同刺激分子、Toll樣受體（TLR）以及NK細胞受體（金伯泉等, 2005）。與T細胞識別、黏附、活化有關的CD分子有CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CD58、CD80、CD86等（吳 敏, 2014）。CD分子在多種途徑起著重要作用, 通常參與免疫細胞整合素、受體、配體等各種蛋白分子的表達, 以及免疫應答反應的識別、黏附和信號轉導等功能。

因此, 為了探討復合益生菌粉對正常小鼠免疫功能的影響, 本研究通過灌服益生菌后檢測Balb/C小鼠外周血中CD3、CD4和CD8的分子表達水平, 探討益生菌調節動物機體免疫功能的作用機理, 以期為其后續的功能評價和合理應用提供依據。

1 材料

1.1 試驗動物 6～8周齡Balb/c小鼠48只, 雌雄各半, 購自河南省鄭州大學試驗動物中心（[SCXK（豫）2010-0002]）。所選小鼠飼養條件一致、健康狀況良好。

1.2 益生菌 主要菌種為枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳桿菌, 均購自中國微生物菌種保藏管理中心, 菌種編號如表1所示。益生菌制劑委托鄭州金百合生物工程有限公司制作, 活菌數為200億CFU/g。

表1 益生菌菌株保藏編號

1.3 主要儀器 全自動高壓滅菌鍋（SX-500）, 日本TOMY；電熱鼓風干燥箱（DHG-9245A）, 上海一恒科學儀器有限公司；高速臺式離心機（TGL-16B）, 上海安亭科學儀器廠；全自動酶標儀（Synergy HTX）美國伯騰儀器有限公司；全自動雪花制冰機（IMS-20）, 常熟市雪科電器有限公司；-20℃冰箱（BCD-197KA）, 河南新飛電器有限公司；小鼠CD3、CD4、CD8酶聯免疫分析試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司, YB-CD3-Mu、YB-CD4-Mu、YB-CD8-Mu）。

2 方法

2.1 試驗動物分組 試驗將48只6～8周齡Balb/c小鼠隨機分為4組, 分別為對照組（C組）、益生菌低、中、高劑量組（P-L、P-M、P-H組）, 每組12只。小鼠分組及具體實施方案如表2所示。

表2 分組及試驗設計

2.2 試驗動物飼養管理和給藥 各組小鼠在室溫條件下分籠飼養, 試驗前對小鼠所處環境進行嚴格消毒, 自由采食、飲水；每天測量小鼠體重后, 試驗組各組小鼠根據體重灌服益生菌, 對照組小鼠根據體重灌服生理鹽水。

2.3 收集血清 初次灌服益生菌當天為第1天, 分別于第7、14、21、28天隨機選取C、P-L、P-M、P-H組小鼠各3只, 眼球采血收集于1.5 mL EP管中, 3000 r/min離心15 min, 收集上層血清, 置于-80℃冰箱保存備用。

2.4 雙抗體夾心ELISA方法 嚴格按照試劑盒說明書檢測血清中T細胞因子CD3、CD4、CD8的表達水平。

2.5 數據分析 采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 8.0軟件對試驗數據進行數據分析和圖表處理, 試驗結果均以“平均值±標準差”表示, 對各項樣本均數兩兩比較, P＜0.05表示組間差異顯著。

3 結果與分析

3.1 益生菌對Balb/C小鼠血清CD3分子表達量的影響 由表3和圖1可知, 正式試驗進行7 d后, 與對照組相比, P-L和P-H組小鼠血清CD3分子表達量分別顯著上升54.78%（P＜0.05）、98.52%（P＜0.05）；14 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD3分子表達量分別上升39.09%、26.17%和53.35%, 但差異不顯著（P＞0.05）；21 d后, P-H組小鼠血清CD3分子表達量與對照組相比顯著升高83.51%（P＜0.05）；28 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD3分子表達量分別上升27.10%、15.25%和32.64%, 但各組差異不顯著（P＞0.05）。P-M組小鼠血清CD3分子表達量隨飼喂益生菌時間的延長呈現出日益增長的趨勢, 并于21 d后達到最大值, 說明該益生菌以中劑量給藥作用較為穩定；P-H組小鼠血清CD3分子表達量最高, 但隨著時間變化并未處于穩定升高狀態, 因此, 高劑量飼喂益生菌時需注意用藥方式。

表3 益生菌對小鼠血清CD3分子表達量的影響 IU/mL

圖1 益生菌對小鼠血清CD3分子表達量的影響

3.2 益生菌對Balb/C小鼠血清CD4分子表達量的影響 由表4和圖2可知, 試驗進行7 d后, 與對照組相比, P-M和P-H組小鼠血清CD4分子表達量分別上升11.89%、7.61%, 但無顯著差異（P＞0.05）；14 d后, 與對照組相比, P-L和P-M組小鼠血清CD4分子表達量分別上升10.89%、5.72%, 但差異不顯著（P＞0.05）；28 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD4分子表達量分別上升36.68%、17.63%和44.14%, 各組差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 益生菌對小鼠血清CD4分子表達量的影響

表4 益生菌對小鼠血清CD4分子表達量的影響 U/mL

3.3 益生菌對Balb/C小鼠血清CD8分子表達量的影響 由表5和圖3可知, 試驗進行7、14、21和28 d時, 飼喂益生菌組小鼠的血清CD8分子表達量分別不同程度高于對照組, 并于7和14 d時顯著高于對照組（P＜0.05）。7 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD8分子表達量分別顯著上升44.94%（P＜0.05）、46.73%（P＜0.05）和43.78%（P＜0.05）；14 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD8分子表達量分別顯著上升39.27%（P＜0.05）、40.05%（P＜0.05）和36.02%（P＜0.05）；21 d后, 與對照組相比, P-M組小鼠血清CD8分子表達量顯著上升50.46%（P＜0.05）, P-L和P-H組小鼠血清CD8分子表達量與對照組相比分別上升17.78%、42.40%, 但差異不顯著（P＞ 0.05）；28 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD8分子表達量分別上升2.75%、6.36%和35.40%, 但無顯著差異（P＞0.05）。血清CD8分子表達量最高值出現在試驗7 d后, 7 d后有所回落, 但表達量仍高于同時間的對照組。說明益生菌對小鼠血清CD8分子表達水平作用效果快, 但效果不夠持續, 可用于短期增強免疫功能。

表5 益生菌對小鼠血清CD8分子表達量的影響 U/mL

圖3 益生菌對小鼠血清CD8分子表達量的影響

4 討論

CD3分子能表達于全部T細胞上, 是成熟T淋巴細胞共有的表面標志, 代表著整個機體的細胞免疫功能（張蕊等, 2012）。CD4分子分布于部分T細胞和胸腺細胞表面, 也發現于某些B細胞、EBV轉化細胞、單核-吞噬細胞和腦細胞（吳敏和徐龍, 2014）。CD4 T細胞識別靶細胞表面的MHC-II抗原肽, 在免疫反應中可以調控和輔助其他淋巴細胞發揮功能。腸道菌群失調會導致炎癥性腸病（IBD）免疫系統功能障礙和慢性炎癥, 腸道微生物可以引發不同的信號并誘導CD4+T細胞分化（Zhang等, 2019）。CD8分子分布在部分T細胞和胸腺細胞, 在特異性免疫反應過程中起到識別和呈遞抗原的重要作用。CD8蛋白是殺傷性T細胞的主要表面標志物, CD8通過表面的MHCⅠ分子與CD4等其他免疫細胞的MHC Ⅱ分子結合, 從而識別其他免疫細胞表面結合的抗原物質, 對病毒感染細胞及腫瘤細胞的靶細胞產生殺傷作用, 是免疫功能的重要組成部分（李朝政等, 2015）。

本試驗結果可以看出, 中劑量添加該益生菌對小鼠血清CD3、CD4和CD8的表達水平的影響最為穩定, 呈現出穩定升高或穩定下降的趨勢。高劑量添加該益生菌對升高小鼠血清CD3分子的表達水平作用最顯著, 且短期使用就有比較明顯的效果, 但需注意高劑量添加益生菌時動物的生理表現, 根據實際情況隨時調整用藥劑量。長期飼喂益生菌對血清內CD8分子的表達量有升高作用, 但升高趨勢隨時間的加長效果逐漸降低, 因此需注意益生菌的用藥時長。由此可以推斷, 該益生菌對Balb/C小鼠的免疫性能有不同程度的改善作用。

益生菌在IBD中發揮的有益作用是眾所周知的, 已有研究已經可以證明益生菌對宿主的健康狀況具有保護和改善作用（杜志琳等, 2016）。有研究表明, 單一或復合益生菌均能有效提高免疫器官指數, 改善血液生化指標, 對小鼠免疫機能具有促進作用, 且復合益生菌治療效果更顯著（黎雨晴等, 2022）。黃蕊蕊等（2021）研究表明, 復合益生菌粉能增強體液免疫、單核-吞噬細胞活性和NK細胞的活性, 具有一定的免疫增強功能。蘇碩楠和侯林中（2022）研究表明, 3種益生菌與低聚果糖復合粉可通過增強細胞免疫、單核-巨噬細胞功能、體液免疫及NK細胞活性來增強小鼠的免疫功能。在動物生產方面, 劉佳（2015）研究表明, 添加復合益生菌制劑對豬只采食量和料重比無明顯變化, 但豬只日增重卻有明顯的提高, 說明豬只體內營養吸收更加充分, 與復合益生素的降解作用有直接關系。這與本試驗的結論一致。

本研究結果揭示, 服用益生菌可以增強Balb/C小鼠細胞免疫功能, 但對體液免疫的影響作用尚未進行, 仍需進一步分析益生菌對血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）含量的影響。