低鹽度養殖凡納濱對蝦對飼料甘氨酸錳為錳源的錳營養需求

程開敏, 劉艷妮, 劉麗燕, 胡 蝶

（1.廣東粵海飼料集團股份有限公司, 廣東湛江 524017；2.廣東省水產動物營養與飼料企業重點實驗室, 廣東湛江 524017；3.廣東粵盛生物科技有限公司, 廣東廣州 510380）

錳是維持大腦正常生理功能的重要元素, 在機體各組織中廣泛分布, 線粒體中的錳含量遠比細 胞 內 其 他 細 胞 器 豐 富（Watanabe等, 1997；Lall, 1989）。錳在蛋白質、脂類與碳水化合物代謝過程中充當許多金屬酶系統的重要激活因子（Davis和Gatlin, 1996）, 而且也是金屬酶的重要組分（Watanabe等, 1997）。由于具有重要的生理生化功能, 錳早已被認為是重要的微量元素成分之一, 這一點早已在哺乳類與鳥類的營養研究中得到印證。關于錳在魚類營養需求研究中報道較多, 由于試驗種類與大小、養殖環境及基礎飼料中的錳含量不同, 魚類對錳的需求范圍為2.4～50 mg/kg（魏 萬 權 等, 2001；趙 振 山 等, 1995；王道 尊 等, 1994；Lall, 1989；Gatlin和Wilson, 1984；Satoh等, 1983, 1987, 1989, 1991；Knox等, 1981；Ogino和Yang, 1980）。盡 管 魚 類 可從水體中攝取錳用以生長需求, 但攝入錳量不足時會表現出營養缺乏癥, 如生長緩慢、食欲低下、脊椎變形、機體平衡性下降、眼球白內障等, 嚴重時甚至影響性腺發育與繁殖機能（Watanabe等, 1997；Gatlin和Wilson, 1984）。關 于 對 蝦 對 錳的營養需求也有部分報告, 諸如中國對蝦（李荷芳等, 1993）、日本對蝦（Kanazawa等, 1984）和凡納濱對蝦（Davis等, 1992；董曉慧等, 2005；魯耀鵬等, 2018）等, 但從其生長表現、實驗設計、養殖水體、實驗結論等方面綜合而言, 有關對蝦對錳的營養需求有必要再行技術論證與補充完善, 尤其是過量添加會增加較大的環境負荷。近些年, 淡水養殖凡納濱對蝦發展迅猛, 據統計, 我國淡水養殖凡納濱對蝦產量比重超過養殖總量的50%（2021年中國漁業統計年鑒）, 但目前缺乏低鹽度養殖下的凡納濱對蝦對飼料錳營養需求的相關研究。

為提高微量礦物元素吸收利用率, 實行增效減排, 國際營養與飼料學界早已研發出有機螯合礦替代無機礦的技術做法, 并已在畜禽飼料應用上取得良好效果。本試驗基于以上種種考慮, 以甘氨酸錳為錳源, 用半精制飼料研究極低鹽度（2‰）養殖條件下凡納濱對蝦對飼料錳的需求量, 以期為低鹽度養殖凡納濱對蝦的商業飼料開發與健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配方 本試驗所用飼料是以酪蛋白與明膠為蛋白源的半精制飼料, 基礎飼料配方見表1。該基礎飼料中錳含量為2.2 mg/kg, 基礎飼料中的粗蛋白質、脂肪及總能含量分別為37.9%、6.8%和17.32 kJ/kg。以甘氨酸錳（廣州天科公司饋贈, 錳含量為16.5%, 氨基酸含量為45%）為錳源, 在基礎飼料中分別添加0、5、10、20、30、60、90 mg/kg的錳。同時使用HP3510型火焰原子吸收分光光度計實測實驗飼料錳含量, 分 別 為2.22, 7.34, 12.70, 21.35, 32.11, 59.72和90.13 mg/kg。在配制飼料過程中, 用SiO2平衡不同水平錳在飼料中的添加量。

表1 試驗飼料的基本配方

各飼料成分（干粉）預先在攪拌器中攪勻后緩慢加入魚油與磷脂, 再加入適量的雙蒸水進一步攪拌, 然后通過雙螺桿擠調機制成粒徑分別為1.0和1.2 mm的飼料, 放入空調房中風干揉搓成適宜長度, 封存放入-20℃冰箱中備用。

1.2 對蝦養殖與環境監控 從粵海種苗場購買2萬尾凡納濱對蝦幼苗（PL-20）（蝦苗養殖環境海水鹽度為28‰）, 在粵海飼料對蝦養殖基地的水泥池中進行低鹽度的淡化馴養, 直至淡化水體的最終鹽度為2‰時為止, 淡化期間水溫（24±2）℃。在養殖試驗開始前用基礎飼料養殖2周以便讓對蝦適應飼料轉換, 同時盡可能降低對蝦體內貯存的錳含量。

試驗初期每個玻璃鋼桶（1個玻璃鋼桶體積0.4 m3, 高0.8 m）放養30尾蝦苗, 試驗初期將平均體重（0.41±0.03）g的對蝦分為7組, 每組3個重復。在整個試驗期間, 養殖水體鹽度控制在2‰, 試驗全過程持續充氣增氧。每天按對蝦體重（濕重）的8%～10%分4次投喂（投喂時間分別是7：00、11：00、18：00和22：00）, 每次投飼量分別是每天總飼量的25%、23%、32%和20%。每天記錄對蝦的攝食與生長動態, 并根據前1 天對蝦的攝食動態適當調整每天的投飼量。每天適量換水1次, 同時排出糞便與殘餌。本次養殖試驗為期10周, 試驗結束前1 天停止投喂飼料。

試驗期間, 定期檢測養殖水質狀況, 水溫、溶 解 氧（YSI-55溶 氧 儀）及pH, 分 別 為（28±2）℃, （8.10±5）mg/L和7.90±0.31。同時測定水質氨氮、亞硝酸鹽與硝酸鹽的含量, 分別 為（0.19±0.02）mg/L, （0.31±0.04）mg/L和（0.62±0.13）mg/L。本試驗所用鹽度為2‰的養殖用水, 預先調配并貯存在專用的蓄水池中備用。用火焰原子吸收法測定養殖試驗用水的錳離子含量, 使其保持在0.01 mg/L以下。

1.3 樣品采集與分析 試驗結束時稱重計數, 同時用1 mL的滅菌注射器從對蝦的圍心竇抽取血淋巴放入滅菌離心管中（每個平行分開放置）, 靜置于4℃條件下過夜。4℃條件下以4000 rpm的速率離心5 min, 取血清存于-80℃的超低溫冰箱中。同時取肝胰腺并進行稱重, 分別剝取對蝦蝦殼與腹部肌肉保存于-80℃用于進一步分析。

用105℃常壓干燥法測定所有樣品的水分, 用550℃高溫爐灼燒法測定灰份含量, 用索氏抽提法測定肌肉粗脂肪含量, 用微量凱氏定氮法測定肌肉粗蛋白質。用試劑盒（購自南京建成生物試劑公司）測定血清Mn-SOD, SOD酶活定義為每毫升血清中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量作為一個SOD活力單位（U）。所有樣品的 鋅（Zn）、鐵（Fe）、銅（Cu）和 錳（Mn）等 微 量元素分析采用干法處理, 并將鹽酸（HCl）與硝酸（HNO3）的混合液（HCl：HNO3=4：1）以1：10（m/V）的比例進行樣品加熱消解, 然后用HP3510型火焰原子吸收分光光度計測定。

本次試驗涉及的公式如下：

1.4 數據統計與分析 本次試驗采用SPSS軟件程序進行統計分析。所有數據采用單因子方差分析, 采用Duncan’s法進行多重比較, P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結果

2.1 對生長與成活率的影響 由表2可知, 10周試驗表明, 成活率從76.67%到90.48%不等, 并沒有因為處理組錳含量的不同而對成活率造成顯著影響, 但生長卻顯著受到錳含量的影響（P＜0.05）, 錳含量為21.35 mg/kg時對蝦增重率為986.67%, 顯著高于對照組的712.47%。在增重率方面, 飼料錳含量超過60 mg/kg時會顯著降低生長。

表2 2‰鹽度攝食10周不同錳水平飼料的凡納濱對蝦增重率、成活率

2.2 對肝胰腺指數與血清酶活力的影響 由表3可知, 在極低鹽度下, 不同錳含量對其肝胰腺指數造成顯著影響（P＜0.05）, 飼料錳含量增加到60 mg/kg以上時, 總體表現出肝胰腺指數會顯著降低。對蝦血清Mn-SOD活力顯著受錳含量的影響, 飼料錳含量為21.35 mg/kg時其活力最大, 隨著錳含量的增加表現出下降趨勢。

表3 不同錳水平對凡納濱對蝦肝胰腺指數及血清超氧化物歧化酶的影響

2.3 肌肉常規成分 由表4可知, 無論是肌肉水分、灰分、粗蛋白質, 還是粗脂肪含量都沒有因為錳含量的不同而表現出顯著性差異。

表4 攝食不同錳水平飼料的凡納濱對蝦肌肉 組成成分 %

2.4 對組織礦物元素的影響 由表5可知, 各處理組對蝦肌肉中的Mn、Zn和Cu含量沒有因攝食飼料錳含量的不同而有顯著差異, 但對Fe含量影響顯著（P＜0.05）。由表6可知, 甲殼中的Fe和Cu含量沒有顯著差異（P＞0.05）；甲殼Mn含量與飼料錳含量相關, 攝食過量的錳會導致甲殼Mn含量顯著升高（P＜0.05）；飼料錳含量顯著影響甲殼中的Zn含量（P＜0.05）, 表現出飼料錳含量對甲殼Zn含量具有抑制作用。由表7可知, 肝胰腺中的Mn會隨飼料錳含量的增加有提升趨勢, 高錳可顯著降低肝胰腺中的Cu含量（P＜0.05）, 而肝胰腺中的Fe與Zn則無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 錳水平對凡納濱對蝦肌肉礦物元素含量的影響 mg/kg

表6 錳水平對凡納濱對蝦甲殼礦物元素含量的影響 mg/kg

表7 錳含量對凡納濱對蝦肝胰腺礦物元素 含量的影響 mg/kg

3 討論

本試驗結果表明, 2‰鹽度下半精制飼料中添加適量的錳有助于對蝦的生長。盡管本試驗中對蝦的成活率沒有顯著差異, 但在生長性能方面表現出顯著差異。與對照組相比, 21.35 mg/kg錳含量組對蝦的增重率最大, 表明基礎飼料中的錳含量不足以滿足對蝦生長需要, 必須在飼料中添加適量的錳, 而且在此水體中錳含量不足0.01 mg/L的條件下, 對蝦不可能從水體中獲得足夠的錳來滿足生長所需。在試驗中, 對蝦的生長未出現平臺期效應, 可能是因為試驗設計的錳梯度較大, 另一方面可能是對蝦對錳的耐受限度較小。添加錳量＞60 mg/kg則會抑制對蝦的生長, 有關原因或代謝機制尚需深入, 但提示飼料錳的添加量應注意不宜過多。

本試驗綜合評估對蝦的增重率與Mn-SOD酶的活力, 推薦對蝦對錳的需求量為21.35 mg/kg（甘氨酸錳為錳源）。這與董曉慧等（2005）的研究看法有點相近, 但也有不同結論認為海水養殖的凡納濱對蝦飼料錳添加量為150-200mg/kg（魯耀鵬等, 2018）。有研究表明, 海水養殖的日本對蝦不需要在飼料中添加錳, 添加30 mg/kg會抑制其生長（Deshimaru和Yone, 1978；Kanazawa等, 1984）。而Davis等（1992）認為, 海水養殖條件下, 半精制飼料中錳添加38 mg/kg與否, 對凡納濱對蝦生長沒有顯著性影響, 并推測對蝦可從海水中吸收錳離子。本實驗與上述結論有所不同, 可能與養殖水體的鹽度和離子含量差異、精制飼料的有別、甚至錳源的選擇與利用等因素有一定關系。關于對蝦對礦物元素的需求研究較難精準, 一個重要的原因就是, 對蝦具有從養殖水體中吸收礦物元素的生物學特性, 部分礦物元素甚至可能從基礎飼料和水體中獲取即可滿足, 尤其是以魚粉為主的飼料中含有一定的微量元素。本實驗中, 2‰極低鹽度的養殖水體肯定比海水中的礦物元素含量少得多, 在很大程度上降低對蝦從水體中的攝入量, 用半精制飼料研究對蝦對錳的營養需求相對更為精準, 可能極低鹽度的養殖水體會因為環境脅迫導致對蝦對其營養需求有所變化。

SOD酶活力已作為反映營養需求、免疫增強與養殖環境脅迫監控等方面的一個指標。在真核生物中, Mn-SOD主要存在于線粒體中, 在清除超氧陰離子的氧化代謝過程中發揮了重要作用（Wang和Chen, 2005；Belinky等, 2002）。Mn-SOD酶活可以被錳離子所誘導, 這在微生物細胞中已被證實。在甲殼動物的免疫體系中, 血淋巴中的SOD酶活力具有重要調制作用（Córdova等, 2002）。在本試驗中, 血清Mn-SOD酶活顯著受到飼料錳含量的影響, 在一定范圍內隨錳含量的增加而增加, 但錳含量超過21.35 mg/kg后, 該酶活性逐步下降。這與魯耀鵬等（2018）在凡納濱對蝦的相關研究結論類似, 同樣在虹鱒（Knox等, 1981）和一些陸生動物（De Rosa 等, 1980）實驗中也有類似報告。

本試驗結果表明, 飼料錳含量雖然對對蝦肌肉蛋白質與脂肪含量沒有造成顯著影響, 但會對對蝦各組織中的銅、鋅與鐵離子的含量產生一定影響, 表現為肌肉中的鐵、甲殼中的鋅以及肝胰腺中的銅離子含量與飼料錳含量總體呈負相關。Mai和Tan（2000）發現, 鮑魚（Haliotis discus hannai Ino.）在攝食硫酸亞鐵與蛋氨酸鐵時, 貝殼中的錳含量無顯著影響, 但攝入硫酸亞鐵時對其軟體組織中的錳含量有抑制作用, 而蛋氨酸鐵并沒有對軟體組織中的錳含量造成顯著影響。有學者發現, 一些甲殼類, 諸如斑節對蝦、墨吉對蝦、加州美對蝦, 其肌肉中錳含量與體重呈 負 相 關（Darmono和Denton, 1990；García和Fowler, 1972）, 但凡納濱對蝦并沒有表現類似趨勢（Páez-Osuna和Ruiz-Fernández, 1995）。

本試驗中, 錳含量在對蝦肌肉中的差異不顯著, 但甲殼與肝胰腺中的含量隨錳含量的增加而顯著上升。Davis等（1992）發現, 養殖海水的凡納濱對蝦攝食不同含量的錳, 其肝胰腺的錳含量沒有顯著差異, 但飼料中沒有添加錳時, 甲殼中的錳含量顯著下降。挪威龍蝦體內錳離子的代謝動力學研究表明, 生活在不同錳離子的水體中, 其肌肉中的錳含量保持相對穩定, 但甲殼中的錳含量增加。在蛻皮后期, 甲殼組織鈣化時錳離子可被吸收到碳酸鈣框架中, 甚至通過甲殼表面的吸附作用直接富集水體中的錳離子, 并在體表形成黑斑；肝胰腺也具有富集錳離子的作用, 尤其是其他組織中的錳離子過剩時, 會直接轉運到肝胰腺中導致錳含量的增加（Baden等, 1999。類似地, 魚類骨骼中的錳含量與飼料錳也有相關性（魏萬 權 和 李 愛 杰, 2001；Gatlin和Wilson, 1984；Satoh等, 1983；Knox等, 1981；Ogino和Yang, 1980）。

4 結論

綜合對蝦生長與有關生理活動等指標, 推薦極低鹽度養殖條件下凡納濱對蝦對錳的需求量為20 mg/kg（甘氨酸為錳源）, 添加錳具有一定的生理功能, 對不同組織微量元素含量與吸收具有一定的影響, 提示在淡化養蝦與商業飼料開發中應關注錳添加的劑型與劑量。