利用近紅外反射光譜檢測豆粕中摻假棉籽粕的研究

鄧凱東, 潘文靜, 陸牡龍, 邊高瑞, 唐 倩, 陳玉華, 何曉芳

（金陵科技學院動物科學與食品工程學院, 江蘇南京 210038）

豆粕作為飼糧中蛋白質的主要來源, 是畜禽養殖中應用最普遍的植物性蛋白質飼料, 因供求關系不平衡, 一些不法商販在利益驅使下, 會在豆粕中摻入其他成分, 以次充好、以假亂真, 擾亂飼料市場秩序, 危害畜禽養殖生產, 造成飼料安全和食品安全隱患。飼料摻假檢測多采用顯微鏡檢、化學分析等方法（陰正興等, 2008）, 但前者只能定性而不能定量分析, 后者測定繁瑣、費時費力、對操作人員和實驗條件要求較高、存在化學試劑污染環境的風險等。近紅外光譜分析是近幾十年發展起來的一種新興技術, 具有分析速度快、樣品適用范圍廣、樣品無需前處理、無需化學試劑、無環境污染、操作相對簡便等優點。近紅外光是指波長介于780～2526 nm的電磁波, 照射物質后會發生吸收、透射、散射和反射, 可反映物質分子中含氫基團（C—H、O—H、N—H、S—H等）的種類和數量, 因此, 近紅外反射（near-infrared reflectance；NIR）光譜適合于各種有機物的定性和定量分析, 已在畜禽飼料原料品質檢測和質量安全控制中廣泛應用（徐淼等, 2019；李玉鵬等, 2017；劉帥等, 2016）, 在食品摻假（?en等, 2021；姚婉清等, 2020；張晶等, 2018；莫欣欣等, 2016；Cattaneo和Holroyd, 2013）和 飼 料 摻假（Rodionova等, 2021；孫丹丹等, 2015；孫丹丹等, 2014；Haughey等, 2013；石光濤等, 2009）的定性鑒別和定量分析中亦具有高度準確性。豆粕中摻雜棉籽粕的NIR光譜分析方法尚未見報道。本實驗擬研究豆粕中摻雜棉籽粕的NIR特征光譜, 通過化學計量學方法建立、優化和評價棉籽粕摻假率的NIR預測模型, 為豆粕摻假定量檢測提供新途徑和新方法。

1 材料與方法

1.1 樣品制備 豆粕和棉籽粕樣品采自江蘇某飼料廠, 用高速旋風式粉碎機（FS-ll, 浙江托普云農科技股份有限公司）粉碎, 使之全部通過1 mm篩, 再用精密天平（準確至0.001 g）稱取豆粕和棉籽粕, 按質量百分比在豆粕中分別摻入0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%棉籽粕, 每個摻假水平各制備樣品30個, 隨機選取20個樣品作為建模集、10個作為驗證集, 各摻假樣品充分混合均勻后, 密封保存于塑料樣品袋中備用。

1.2 NIR光譜模型建立 通過傅里葉變換近紅外光譜儀（Tensor II, Bruker公司, 德國）獲取樣品的NIR光譜, 附件選用漫反射積分球（IntegratIR, PIKE Technologies, Inc.）, 掃 描光譜波數范圍為10000～4000 cm-1（波長1000～2500 nm）, 以空白背景作為參比。樣品裝填至掃描石英管容積2/3處, 每個樣品平行掃描采集光譜3次。實驗環境溫度為22℃, 近紅外光源預熱1 h后, 按照儀器操作規程檢測近紅外光源信號干涉峰強度和幅度正常后開始采集樣品NIR光譜。

樣品NIR光譜由儀器自帶的化學計量學軟件OPUS（版本7.5；Bruker公司, 德國）自動獲取和處理。建模集樣品共采集了420個NIR光譜數據, 其中14個被OPUS軟件判別為異常值而被剔除, 其余406個數據用于建模。建模集樣品的NIR光譜通過OPUS軟件自動擬合預測模型, 包括采用矢量歸一化（SNV）、多元散射校正（MSC）、減去一條直線、最小—最大歸一化、消除常數偏移量、線性補償差減法等方法對原始光譜進行預處理, 保證光譜數據和含量數據間良好的相關性, 再通過偏最小二乘法（PLS）擬合豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜預測模型, 最后再經過優化和檢驗, 根據交叉驗證均方根誤差（RMSECV；代表預測模型誤差）, 并結合決定系數（R2）和斜率, 確定最優預測模型：RMSECV越接近0、R2和斜率越接近1, 預測模型越準確。

1.3 NIR光譜模型驗證 每個摻假水平的10個驗證集樣品（共計60個）采用與上述相同的方法獲取NIR光譜, 帶入上述擬合的NIR預測模型中, 計算棉籽粕摻假率的預測值, 再與摻假率真值比較, 擬合預測值與真值回歸方程, 并計算預測值的絕對誤差和相對誤差, 用于驗證NIR預測模型的準確性。

2 結果與分析

2.1 NIR預測模型評價 純豆粕和摻雜5%～30%棉籽粕的豆粕NIR光譜見圖1。經OPUS軟件判別, 摻雜棉籽粕的豆粕NIR特征光譜范圍為6102.3～4247.6 cm-1, 約為近紅外光譜的最后1/3范圍, 即棉籽粕摻假比例不同的豆粕NIR光譜在上述光譜范圍存在明顯差異；在其他譜區, 則無差異。表1為利用OPUS軟件在不同維數下擬合的建模集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜預測模型評價參數。OPUS軟件根據R2、RMSECV、斜率和預測偏差等參數選擇最佳維數, 確定最優預測模型。豆粕摻假棉籽粕的NIR光譜預測模型的推薦維數是5, 最優預測模型的R2為0.975、RMSECV為1.58, 斜率為0.974（圖2）。

圖1 純豆粕（上）和摻雜不同比例棉籽粕的豆粕（下）NIR光譜

圖2 建模集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR模型預測值和真值關系

表1 不同維數下建模集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜預測模型評價參數

2.2 NIR預測模型驗證 驗證集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜模型預測值和真值回歸關系見圖3。驗證集豆粕中棉籽粕摻假率預測值和真實值回歸方程R2為0.960。隨著豆粕中棉籽粕摻假比例由5%逐步增加至30%, NIR光譜模型預測值的相對誤差則由15.0%降低至0.87%（表2）。

圖3 驗證集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜模型預測值和真值關系

表2 驗證集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜模型預測值驗證

3 討論

化學計量學軟件OPUS鑒別出豆粕中棉籽粕不同摻假含量的NIR特征光譜范圍為6102.3～4247.6 cm-1, 說明摻入不同水平棉籽粕的豆粕NIR光譜在特定范圍內出現差異, 也證實了以NIR光譜分析技術對棉籽粕摻假量進行定量預測是可行的, 為定量分析棉籽粕摻假量提供了建模依據。Haughey等（2013）研究發現, 豆粕中摻入0.1%～2.0%三聚氰胺的NIR特征光譜范圍為9000～4000 cm-1。孫丹丹等（2014）則報道, 豆粕中摻入3%三聚氰胺或尿素后, NIR特征光譜分別出現在5066 cm-1和6812 cm-1附近, 反映了兩種摻假物中含H集團氨基（-NH2）的變化。豆粕中摻入5.00%尿素聚合物的NIR特征光譜范圍為7567～3695 cm-1區間, 反映了尿素聚合物中氨基（-NH2）和羥基（-OH）的變化（孫丹丹等, 2015）。此外, 魚粉中摻入0.1%～15.0%三聚氰胺的NIR特征光譜范圍包括7560.0～7058.5、6915.8～6098.1和4601.6～4246.7 cm-1三 段（劉小莉等, 2010）。石光濤等（2009）發現, 魚粉中摻雜2%～50%豆粕的NIR特征光譜范圍為5882.4～5555.6 cm-1。魚粉中摻入1%～33%肉骨粉后, NIR光譜在5882.4 cm-1附近出現顯著差異, 這主要是由于魚粉和肉骨粉的蛋白質和飽和脂肪酸含量差異所致（楊增玲等, 2009）。

豆粕中摻假棉籽粕含量的NIR光譜最優預測模型的決定系數達到0.975（表1和圖2）, 表明NIR光譜預測模型的擬合性好, 預測準確性高, 可以準確定量預測豆粕中摻雜的棉籽粕含量。利用NIR光譜可以準確檢驗豆粕中摻入的三聚氰胺, 在去皮豆粕或烘烤豆粕中摻入0.1%～2.0%三聚氰胺的NIR光譜預測模型的R2介于0.89～0.99, RMSECV為0.081～0.276（Haughey等, 2013）。魚粉中摻雜0.1%～15.0%三聚氰胺的NIR光譜定量分析最優模型的R2則為0.948（劉小莉等, 2010）。此外, 定量分析魚粉中摻假肉骨粉含量的NIR光譜預測模型R2分別達到了0.90（湛小梅等, 2009）、0.94（Murray等, 2001）和0.95（楊 增 玲等, 2009）。石光濤等（2009）擬合了魚粉中摻雜2%～50%豆粕的NIR光譜定量預測模型, 發現最優預測模型的R2為0.989。本實驗所擬合的豆粕中棉籽粕摻假量的NIR光譜預測模型的R2數值上高于上述報道的魚粉中摻假物含量的NIRS預測模型（劉小莉等, 2010；楊增玲等, 2009；湛小梅等, 2009；Murray等, 2001）, 這可能與實驗材料、樣本含量、光譜儀器、建模軟件和建模方法等因素不同有關。此外, 綜合文獻結果和本實驗結果可以看出, 飼料中各種摻假物含量的NIR光譜預測模型R2普遍≥0.90, 說明NIR光譜模型的擬合性好, 可以準確定量分析飼料中摻假物含量。

本研究將擬合的NIR定標模型對驗證集樣本的棉籽粕含量進行預測, 以檢驗NIR光譜定量分析模型的預測準確度和可靠性。結果表明, 驗證集的棉籽粕摻假率預測值和真實值間回歸方程的R2為0.960, 說明預測模型的準確性較高（圖3）。姚婉清等（2020）報道, 通過NIR光譜模型預測的山茶油中玉米油和花生油摻假比例與摻假真值無顯著差異, 預測值相對誤差＜6%。NIR光譜技術還可以準確區分甜蕎粉、苦蕎粉、小麥粉和燕麥粉, 在苦蕎粉中摻入10%、25%和50%小麥粉后, 通過NIR光譜模型預測的小麥粉含量的相對誤差為4.6%（張晶等, 2018）。孫丹丹等（2014）利用NIR光譜技術對豆粕中摻入0.1%～5.0%三聚氰胺或尿素進行判別, 擬合的NIR光譜預測模型對摻入三聚氰胺樣品的驗證集判別準確率＞95.3%, 摻入尿素樣品的驗證集判別準確率＞94.2%。利用NIR光譜技術對豆粕中摻入0.08%～5.00%尿素聚合物進行判別, 擬合的NIR光譜預測模型對摻入尿素聚合物樣品的最低檢測含量為1.00%, 判別準確率＞99.0%（孫丹丹等, 2015）。

本實驗的NIR光譜預測模型驗證結果表明, 隨著豆粕中棉籽粕摻假率由5%增加至30%, NIR光譜定量分析模型預測值的相對誤差呈逐步降低趨勢, 由15.0%降至0.87%（表2）。當棉籽粕摻假率≥10%時, NIR光譜定量分析模型預測值的相對誤差＜2%, 說明豆粕中棉籽粕摻假比例=5%時, 預測模型的準確度有待提高；摻假比例為10%～30%, 預測模型的準確性很高。楊增玲等（2009）擬合了魚粉中摻入1%～33%肉骨粉的NIR光譜預測模型（R2=0.95）, 對驗證集魚粉中肉骨粉含量的總體正確判斷率為95.6%；當肉骨粉摻入量≥5%時, 正確判斷率提高至100%。劉小莉等（2010）擬合了魚粉中摻雜0.1%～15.0%三聚氰胺的NIR光譜定量分析模型發現, 模型對三聚氰胺摻雜量居中者的預測誤差均低于摻雜量偏低和偏高者, 且針對0.1%～5.5%三聚氰胺模型的預測誤差亦低于0.1%～15.0%三聚氰胺模型, 由此推斷, 將較寬建模濃度范圍劃分為若干小范圍分別建立模型, 可能有利于提高NIR光譜模型的擬合能力和預測準確度。今后尚需研究改善豆粕中低水平棉籽粕摻假率（～5%）的NIR光譜預測模型擬合度和準確性的措施, 并確定利用NIR光譜技術定量檢測豆粕中摻假棉籽粕含量的最低檢測限。

4 結論

豆粕中摻假棉籽粕含量的NIR光譜預測模型R2為0.975, RMSECV為1.58, 表明NIR光譜定量分析模型擬合性好, 預測準確性高。驗證集豆粕中棉籽粕摻假比例的NIR光譜模型預測值與真值的回歸方程R2為0.960, 棉籽粕摻假比例為10%～30%時, NIR光譜模型預測值的相對誤差為0.87%～1.87%。因此, NIR光譜預測模型可以準確定量分析豆粕中棉籽粕摻假量, 為豆粕中摻假物鑒別提供了一種準確、可靠的定量方法。