番茄中Ty-1 抗性機制研究

黃 毅

（貴陽職業技術學院，貴州 貴陽 550081）

1 Ty-1 特性

番茄黃葉卷曲病毒（TYLCV）是世界上最具毀滅性的植物病毒之一。為了抵御這種病毒，一些抗性基因被用于育種中。植物基因組中存在的抗病基因通過產生R 蛋白，為植物抵抗病原體提供抗病能力。在這些基因中，Ty-1 抗性基因的應用最為廣泛，許多商業雜交品種都攜帶Ty-1[1]。Ty-1 最早在1969 年智利南部發現，在最初的大規模重組篩選中首次提出了Ty-1 的簡單圖譜，如今已經鑒定并克隆了Ty-1 抗性基因。雖然Ty-1 不編碼經典的NBS-LRR 基因，也不產生涉及超敏反應（HR），但Ty-1 影響病毒的復制或移動，含有該基因的植物表現出更多的耐受性。

RNA 沉默是一種基于序列同源性的基因調控機制，保留在真核生物中，不僅與調節基因表達有關，還抵御轉座子等寄生遺傳因素，并控制轉基因和病毒[2]。RNA 沉默，也稱為RNA 干擾（RNAi），通常被認為是植物和昆蟲中的一種抗病毒防御機制，也被證明在哺乳動物中起到抗病毒作用。在RNAi 的機理過程中有4個關鍵部分：長雙鏈RNA（dsRNA）、21-26 nt 短干擾RNA小鏈（siRNA）、內核糖核酸酶（Dicer）和RNA 誘導沉默復合物（RISC）（見圖1）。

圖1 RNAi 沉默機制

在植物中，RNA 病毒通過轉錄后基因沉默（PTGS）作為靶標，而像雙子病毒的DNA 病毒則通過轉錄后基因沉默（TGS）作為靶標[3]。PTGS 和TGS 的抗性策略不同（見圖2），TGS 通過細胞核中的DNA 甲基化與轉座子的調節有關，而PTGS 通過細胞質中的長雙鏈RNA調節病毒感染。在植物中，病毒和轉基因都能通過PTG誘導基因沉默，這一過程被普遍認為是植物抵御某些病毒病原體感染的組成部分。

圖2 基因沉默和轉錄后基因沉默模型

RNA 誘導DNA 甲基化（RdDM）已被植物用作對抗雙子病毒的表觀遺傳防御[4]（見圖3）。在RdDM的過程中，涉及兩種關鍵酶——RDR2 和DCL3。RDR2 是一種功能酶，可調節內源性植物siRNA 和病毒次級siRNA的生物合成，并在RdDM途徑中靶向dsRNA 的轉化。dsRNA 被消化成大小不同的siRNA，主要是24nt（由DCL3 產生）、21nt（由DCL4 產生）和22nt（由DCL2 產生）。不同大小的siRNA 具有不同的功能，例如，24-nt siRNA（與DCL3 相關）可能指導病毒DNA 甲基化和轉錄沉默。DCL3 是一種RNA 酶Ⅲ樣酶，屬于由4 個原型成員組成的家族，參與RDR 最后一步，以幫助24-nt siRNA 的發生。重要的是，DCL3 和24-nt siRNA 顯然與染色質甲基化有關。

圖3 RNA 誘導DNA 甲基化模型（Pooggin 2013）

2 研究目標

分析Ty-1 是否對其他雙子病毒有抗性，Ty-1 番茄植株將受到BCTV 侵染，將其與易感MM系的含量進行比較分析。根據最新研究，Ty-1 不是TYLCV 的特異性，也可以對抗其他雙子病毒甚至其他DNA 病毒，例如，Ty-1 似乎也能控制不同（雙組分）雙病毒物種的耐受性反應，如ToSRV。但是幾乎沒有關于Ty-1 對其他病毒的耐藥性研究[5]。

3 試驗方法

3.1 植物

番茄試樣MM、Ty-1、Ty-2 的種子在土壤中，24 ℃和60%相對濕度的溫室條件下，光照16 h、夜間8 h 養護3 周生長。煙草置于相同的溫室條件下。在接種大約3～4 周后，將番茄試樣的頂部葉片采摘并在-20 ℃下儲存至使用。

3.2 TYLCV，BCTV，ToSRV 接種

用番茄黃葉卷曲病毒、甜菜卷曲頂病毒或番茄皺紋病毒對番茄品系進行接種。將含有該病毒克隆的根癌農桿菌（A.tumefaciens）轉化并在3 mL LB3 培養基中與6 μL 卡那霉素和3 μL 利福平抗生素一起培養。液體培養物在28 ℃溫度下以180 rpm 搖動過夜。第二天，將600 μL 過夜培養基轉移到3mL 誘導培養基中，相同條件下培養。懸浮在3 mL MS-MES 培養基中，樣品以3 500 rpm 離心20 min 后充分混合。測量OD600為0.5 時稀釋。在溫室條件下，用無針注射器加壓5 mL接種，對3 周齡番茄植株進行滲透。

3.3 DNA 提取和PCR 分析

為了確認敏感番茄試樣中是否存在BCTV 的DNA，設計BCTV 引物進行PCR 正向引物（5`-TGTAVT VVGATVGAGCGTGTT-3`）和反向引物（5`-TCATACAA CGAACACTTCATGA-3`），產物長度為700 bp。

從6 周幼苗中分離DNA，用液氮中研磨1 g 植物樣后，與分離DNA 緩沖液混合。用Eppendorf 旋轉約2 min 后，以12 000 rpm 的轉速旋轉5 min，將透明液體移到新管中。洗滌后用離心機以12 000 rpm 的速度去除多余液體。向每根試管中加入30 μL 的G.lig EB，等待3 min。試管在12 000 rpm 下旋轉2 min 后準備進行PCR。使用1ul DNA 提取物作為模板，檢查DNA 片段擴增。

4 結果

4.1 BCTV 克隆成功感染Nicotiana benthamiana

BCTV 對番茄品種和煙草影響不同。對于番茄而言，其會導致植株發育遲緩、變黃、葉脈膨脹變紫、向上卷曲葉片。其對煙草特有的癥狀是向下卷葉和發育遲緩。

在測試Ty-1 是否也具有對不同于TYLCV 的雙子病毒的抗性之前，將BCTV 的一種PGV 3850 農桿菌克隆接種在本氏煙上，測試其傳染性。PGV 3850 接種后13 d，本氏煙下葉出現黃變、壞死等癥狀。為了確認是否存在BCTV，采用特異性PCR 引物檢測病毒的存在。結果顯示預期大小為700 bp 的條帶，說明設計的引物對擴增BCTV有用，進一步說明本生煙已被BCTV感染。

4.2 Ty-1 系列表現出對BCTV 的抗性

為測試Ty-1 是否也能抵抗其他雙子病毒，用BCTV 克隆對Ty-1 番茄植株進行接種，以測定感染后的病毒含量，并與敏感MM進行比較。采用煙草響尾蛇病毒（TRV）的病毒誘導基因沉默（VIGS）方法構建了兩個VIGS 結構，分別用于Solyc06g051180 的TRV2-180和Solyc06g051190 的TRV2-190。

由于Solyc06g051180 和Solyc06g051190 之間同源性較低，兩個VIG 載體TRV2-180 和TRV2-190 是特異性的，并且都被假定為單個RDR。含有Ty-1 的植株通過TRV2-180 或TRV2-190VIG 進行侵染沉默，出現TYLCV 疾病癥狀并觀察抗性受損。在用BCTV 感染之前，首先用TRV2-180 和TRV2-190 對Ty-1 植株進行接種，使VIGS 沉默Ty-1 并損害其抗性。作為對照，在Ty-1 植株上接種TYLCV。Ty-1 和MM在溫室中播種，1 周后移栽到不同的花盆中，用TRV2-180 或TRV2-190進行接種。約3 周后，感染葉片表現為發育遲緩、變黃、葉脈腫脹、變紫以及向上卷曲的葉片（見圖4）。在對Ty-1 進行VIG 沉默的MM和Ty-1 植株上，癥狀清晰可見，典型癥狀是感染TYLCV 的葉片變黃和卷曲。對于受到BCTV 攻擊的Ty-1 和MM番茄植株，這些癥狀表明，Ty-1 的VIGS 沉默（TRV2-180 和TRV2-190）相對于未被VIGS 沉默的Ty-1 系表現出比BCTV 更明顯的癥狀，如嚴重發育遲緩、向上卷曲葉片、發育緩慢。相比之下，在BCTV 侵染的Ty-1 株系上幾乎看不到癥狀，而少數Ty-1 植株表現出與MM相似的癥狀。

圖4 Ty-1 和MM 分別被TYLCV 或BCTV 侵染后的癥狀

4.3 擴增BCTV 片段并進行PCR 檢測

為了檢測感染的Ty-1 番茄葉片中BCTV 含量，采用qPCR 方法對RV2-180/190 VIGS 沉默的Ty-1 植株、Ty-1 植株和易感MM 番茄中的BCTV 滴度測定。分析前，設計了一套特定的引物，從這些感染的植物樣本中PCR 擴增BCTV 片段，并獲得約700 bp 的產物。作為對照，加入TYCLV 感染樣本，并使用設計成功的引物進行測試，得到了300 bp 的產物。在被侵染的植物中用PCR 檢測BCTV 的DNA（見圖5），結果顯示，MM 株系和TRV2-180/190 VIGS 沉默的Ty-1 番茄植株樣本分別呈現預期的DNA 產物，其中TYLCV 為300 bp，BCTV 為700 bp。由此可以證明MM 系和TRV2-180/190 VIGS 沉默的Ty-1 番茄植株系已感染BCTV。使用BCTV 引物對所有試驗植物的分離樣本進行PCR，以擴增BCTV，并證明所有MM 系和TRV2-180 VIGS 沉默的Ty-1 系均成功感染BCTV。但結果顯示，其中一個Ty-1 樣本也感染了BCTV。

圖5 在被侵染的植物中用PCR 檢測BCTV 的DNA

4.4 用qPCR 測定BCTV 有效量

BCTV 的侵染成功和PCR 引物的確定后，分別對Ty-1 植株、感病MM番茄和TRV2-180/190 VIGS 沉默的Ty-1 番茄葉片樣本進行qPCR 檢測，以確定BCTV滴度。內部對照，在Butterbach 等人的TYLCV 試驗的Ty-1 的qPCR 分析中使用了GFP 基因的Ty-1 進行的qPCR 分析相同。

根據qPCR 結果，在樣本中觀察到不同的BCTV病毒滴度（見圖6）。正如預期，從易感MM采集的大多數植物樣本中普遍觀察到較高的滴度，而在Ty-1 中觀察到較低的滴度，但樣本除外。由于Ty-1 的VIGS沉默在早期損害了對TYLCV 的抗性，因此經類似處理（TRV2-180 或TRV2-190）并隨后用BCTV 激發的Ty-1 植株顯示出比Ty-1 更高的滴度以及與MM相似的滴度水平，并進一步表明Ty-1 的VIGS 沉默損害了對BCTV 的抗性，結果表明Ty-1 對BCTV 具有抗性。雖然Ty-1 株系的平均滴度低于對照組，但一個Ty-1株系樣本顯示出比其他Ty-1 株系更高的含量（見圖7）。

圖6 qPCR 分析BCTV 分別侵染MM、Ty-1 lines、TRV2-180 和190 VIGS-silenced Ty-1

圖7 2-ΔΔCt 方法分析qPCR 結果

5 討論

試驗植物表現出了預期癥狀，BCTV 的PCR 結果與陽性對照（TYLCV）相同，從而證明MM、TRV2-180或TRV2-190 VIGS 沉默的Ty-1 系感染了BCTV。通過qPCR 方法在Ty-1 系中產生的較低滴度，在大多數易感MM和TRV2-180 VIGS 沉默的Ty-1 系中產生的滴度較高，綜上結果Ty-1 確實對BCTV 產生了抗性。

另外，觀察到一株被BCTV 攻擊的Ty-1 番茄植株表現出易感MM 番茄的癥狀，這株Ty-1 番茄植株被BCTV 感染，產生了更高的滴度。結果表明該Ty-1 番茄植株不對抗BCTV，Ty-1 通過增強TGS 而產生抗性。可能Ty-1 番茄植株不能產生足夠的siRNA 信號，會導致TGS 抑制和RNAi 沉默失敗。目前尚不清楚這種新型Ty-1 植物產生的原因和機制，因此在不久的將來對其進行研究將是一個挑戰。