反復種植失敗患者的外周血Th17/調節性T淋巴細胞的失衡情況▲

黃千貽 江 莉 李柳銘 吳惠梅 李慕軍

(廣西醫科大學第一附屬醫院生殖醫學研究中心，廣西南寧市 530021)

近年來，考慮到體外受精技術的進步及每個周期移植胚胎數量的減少，越來越多的生殖學家建議將反復種植失敗(repeated implantation failure，RIF)定義為不孕患者連續兩次體外受精周期(包括凍融胚胎移植周期)累積移植卵裂期優質胚胎個數≥4個或優質囊胚個數≥2個，而未獲得臨床妊娠[1-2]。胚胎植入及胎盤形成過程受一系列細胞因子、核轉錄因子和分泌蛋白的調控，這些因子或蛋白表達失衡或功能異常均可導致胚胎移植失敗。母胎界面的免疫調節對妊娠結局起重要作用。一直以來，學者們主要關注母胎界面Th1/Th2平衡的相關研究。近年來，越來越多研究表明，Th17和調節性T淋巴細胞(regulatory T lymphocyte,Treg)分別作為效應性細胞和調節性細胞參與妊娠的建立和維持[3-4]。二者之間的免疫平衡是維持免疫環境穩定的必需條件，一旦失衡可能導致妊娠失敗及某些不良妊娠疾病的發生，如不明原因復發性流產(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)、早產、RIF等[5-7]。本研究擬通過檢測Treg、Th17及相關因子在RIF患者外周血中的表達情況，探討Th17及Treg與RIF發病的相關性，為尋找RIF的有效臨床治療靶點提供證據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月1日至9月30日因“輸卵管因素(除輸卵管明顯積水外)”在我院生殖醫學研究中心行胚胎移植的26例RIF患者作為RIF組，年齡(30.88±2.64)歲。納入標準：既往2次及2次以上胚胎移植失敗，每次移植至少有1枚優質胚胎(優質胚胎標準為卵裂期胚胎分級按數量和等級分類，優質胚胎為6個或6個以上細胞，碎裂率<10%，沒有多核)，宮腔鏡檢查無異常，內分泌功能正常。排除標準：(1)卵巢儲備功能差，即年齡>38歲，或獲卵數≤3枚，或基礎卵泡刺激素≥20 IU/mL者；(2)有活動性疾病，包括自身免疫性疾病等；(3)宮腔形態異常者；(4)輸卵管明顯積水者；(5)胚胎移植前B超提示子宮內膜厚度<7 mm者；(6)染色體異常者；(7)多囊卵巢綜合征者；(8)子宮內膜異位癥者；(9)抗精子抗體、抗子宮內膜抗體、抗心磷脂抗體、抗卵巢抗體陽性者，自然殺傷細胞數量異常者；(10)男方存在不孕因素者。納入27例非妊娠期且生育功能正常的女性作為對照組，年齡(30.43±3.58)歲。納入標準：年齡<38歲，至少1次成功妊娠，月經周期規則(21～35 d)。排除標準：有不孕史或妊娠流產史者。所有研究對象均了解研究方案并簽署知情同意書。兩組患者的年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已通過廣西醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會的審查。

1.2 主要試劑與設備 Ficoll-Paque PLUS淋巴細胞分離液(批號：17-1440-03)購自美國GE公司，多甲藻黃素-葉綠素-蛋白復合物 (peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP)-CyTM5.5小鼠抗人CD4單克隆抗體(批號：560650)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的小鼠抗人CD25單克隆抗體(批號：557138)、Alexa Fluor?647小鼠抗人叉頭狀/翅膀狀螺旋轉錄因子P3(forkhead/winged-helix transcription factor P3,FOXP3)單克隆抗體(批號：560045)、PE標記的小鼠抗人白細胞介素(interleukin,IL)-17A單克隆抗體(批號：560436)、相匹配的同型對照抗體PE Mouse IgG1κ(批號：556650)、蛋白轉移抑制劑(含莫能霉素，批號：554724)均購自美國BD Pharmingen公司，離子霉素(批號：9995s)購自美國Cell Signaling Technology公司，佛波酯(批號：P8139)購自美國Sigma-Aldrich公司，反轉錄試劑盒(批號：PRR047A)購自大連寶生物工程有限公司、熒光定量PCR試劑盒(mix)(批號：4913914001)購自美國Roche公司， 轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1；批號：CSB-E04725h)、IL-10(批號：CSB-E04593h)、 IL-6(批號：CSB-E04638h)、IL-17A(批號：CSB-E12819h)和IL-23(批號：CSB-E08461h) ELISA試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司，TAE緩沖液(批號：N10053)購自上海雙螺旋生物科技有限公司，TRIzol試劑(批號：15596-026)購自賽默飛世爾科技公司。Facscanto Ⅱ型流式細胞儀購自美國BD Pharmingen公司，MX3000型實時熒光定量PCR儀購自美國Stratagene公司，Model-450型酶聯免疫檢測儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血單核淋巴細胞的提取：采集兩組研究對象處于月經周期增殖晚期時的外周血約3 mL，裝于抗凝管內(含肝素0.1 mL)，根據試劑說明書的相關步驟，采用Ficoll-Hypaque不連續密度梯度離心法，分離出外周血單核淋巴細胞。

1.3.2 流式細胞術檢測外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg比例：采用PBS重懸外周血單核淋巴細胞，在細胞懸液的樣本管和對照管中加入PerCP-CyTM5.5小鼠抗人CD4抗體2 μL，隨后在樣本管中加入PE標記的小鼠抗人CD25抗體10 μL，同時在對照管中加入10 μL同型對照PE Mouse IgG1κ，室溫避光孵育30 min。經PBS洗滌2次后棄上清，加入破膜液混勻，室溫避光孵育30 min。洗滌棄上清，將Alexa Fluor?647小鼠抗人FOXP3抗體及同型對照抗體PE Mouse IgG1κ各20 μL分別加入到樣本管和對照管中，室溫避光孵育30 min。經PBS液洗滌2次后，加入2%多聚甲醛300 μL重懸，4 ℃冰箱避光保存，24 h內上流式儀檢測，計算CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值。

1.3.3 流式細胞術檢測人外周血CD4+IL-17A+Th17：用RPMI-1640重懸外周血單核淋巴細胞后，依次加入離子霉素、佛波酯、蛋白轉移抑制劑，于37 ℃、5% CO2培養箱孵育5 h。收集細胞裝于干燥的流式管中， PBS洗滌2次。在100 μL的細胞懸液中加入PerCP-CyTM5.5小鼠抗人CD4抗體2.5 μL，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗滌后加入固定破膜劑250 μL，4 ℃避光孵育20 min。使用通透清洗緩沖液(1×)洗滌細胞2次，將PE標記的小鼠抗人IL-17A及同型對照PE Mouse IgG1κ各12 μL分別加入到樣本管和對照管中，4 ℃避光孵育30 min。使用通透清洗緩沖液(1×)洗滌細胞2次后加入通透清洗緩沖液(1×)重懸，4 ℃冰箱避光保存，24 h內上流式細胞儀檢測，計算CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測FOXP3及視黃酸受體相關孤兒受體γt mRNA的表達：采用TRIzol試劑提取外周血單核淋巴細胞總RNA，然后反轉錄為cDNA，以此為模板行PCR擴增。FOXP3上游引物序列為TCCCAGAGTTCCTCCACAAC，下游引物為ATTGAGTGTCCGCTGCTTCT，退火溫度為60 ℃，PCR產物為122 bp；視黃酸受體相關孤兒受體γt(retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma t,RORγt)上游引物序列為CTCTGCAAGACTCATCGCCA，下游引物序列為CCACAGGTGACTCGGTTTCA，退火溫度為60 ℃，PCR產物為184 bp。內參α-actin的上游引物序列為CAGGCACCAGGGCGTGAT，下游引物序列為TAGCAACGTACATGGCTGGG，PCR產物為293 bp。PCR反應體系總體積20 μL，包括Mix 10 μL、上游引物0.6 μL(10 μM)、下游引物0.6 μL(10 μM)、cDNA 1 μL，雙蒸水7.8 μL。PCR反應條件為預變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環；60 ℃收集熒光信號。擴增結束后，按儀器默認條件收集熒光，分別測定待測樣本目的基因及內參基因的Ct值。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.3.5 ELISA檢測血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平：采集外周血2 mL，裝入真空干燥管內，室溫下靜置2 h，4 ℃、2 000 r/min離心15 min。按照ELISA試劑盒說明書的步驟，檢測血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。呈正態分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料采用[M(P25,P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值及CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值的比較 RIF組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值低于對照組，而CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值高于對照組(均P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 兩組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值及CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值的比較(x±s)

圖1 兩組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg的檢測結果

圖2 兩組外周血CD4+IL-17A+Th17的檢測結果

2.2 兩組外周血FOXP3 mRNA及RORγt mRNA表達量的比較 RIF組FOXP3 mRNA表達量低于對照組，而RORγt mRNA表達量高于對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組外周血FOXP3 mRNA及RORγt mRNA相對表達量的比較(x±s)

2.3 兩組血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平的比較 與對照組比較，RIF組Treg相關的細胞因子TGF-β1和IL-10水平偏低，而與Th17相關的細胞因子IL-6、IL-17A和IL-23水平偏高(均P<0.05)。見表3。

表3 兩組血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平的比較

3 討 論

在胚胎移植過程中，具有移植潛能的優質胚胎及良好的子宮內膜內環境對于胚胎移植的成功有著至關重要的作用。但對于RIF患者，即使存在優質胚胎，仍然無法獲得成功妊娠。研究表明，免疫特別是免疫耐受的相關基因及細胞因子，在胚胎移植過程及妊娠維持中具有至關重要的作用[8-9]。最新研究顯示，約有81.7%的RIF患者存在子宮內膜免疫失調[10]，RIF的發生可能與子宮內膜免疫平衡遭到破壞致使免疫耐受下降有關。

近年來，越來越多證據表明，Th17和Treg參與妊娠的建立和維持[3，11]，其中Treg在胚胎植入時發揮重要作用[12]。Treg屬于抑制性CD4+T淋巴細胞亞群，在阻止同種異體移植排斥中發揮極其重要的作用[13]，其通過表達TGF-β、IL-10、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4等因子來發揮免疫調節作用[14]。Treg能抑制由胎兒引起的免疫反應，其數量的減少與生殖失敗相關[15-16]。此外，外周血和子宮內膜Treg數量的增加在分泌中期的胚胎移植過程中發揮重要作用[17]。FOXP3是在Treg上特異性表達的標志物，也是初始T淋巴細胞被誘導成Treg的主要基因[18]。因此，本研究將Treg定義為CD4+CD25+FOXP3+Treg，取代以往較多研究所采用的CD4+CD25+Treg，以便能更好、更真實地評估Treg的作用。Th17可分泌細胞因子IL-17，從而促進炎癥、自身免疫和移植排斥的發生[19]。RORγt是決定Th17分化的主要轉錄因子，特異性表達于T淋巴細胞，其功能是調節胸腺和外周血中效應T淋巴細胞的發育及分化，誘導和刺激效應性T淋巴細胞Th17分泌促炎細胞因子[20]。因此，RORγt在某種程度上能反映Th17的功能活性及細胞數量水平。在沒有第二信號促炎細胞因子存在的免疫環境下，FOXP3能抑制RORγt同時朝向Treg分化[20]。

蛻膜組織的T淋巴細胞變化最能直接反映母胎界面的免疫環境，但在實際工作中卻很難采集胚胎植入后種植部位的蛻膜組織。有研究表明，蛻膜細胞的Treg可能是在胚胎移植后從外周血Treg池募集而來的[21]。人Treg能從外周血選擇性遷移到蛻膜組織上，妊娠早期蛻膜組織CD4+CD25+Treg的數量約為外周血的3倍[22]，而且蛻膜組織Treg水平的降低與外周血Treg水平降低有關[23]。有研究者認為，外周血Treg的比例可能是一個預測體外受精治療獲得良好結局的新指標，胚胎移植成功的體外受精患者的外周血Treg比例高于失敗者，同時外周血單核淋巴細胞中FOXP3的mRNA表達量也顯著升高[24]。此外，有研究者認為，外周血和子宮內膜FOXP3+Treg在排卵前就發生增殖，其也許是潛在性地準備接受妊娠相關的抗原刺激，以便在分泌中期胚胎植入階段發揮免疫耐受作用[17，25-26]。效應性T淋巴細胞與Treg的平衡可能從圍植入期就開始發生改變。因此，本研究通過檢測月經周期的增殖晚期外周血的Th17/Treg平衡情況，間接反映種植窗期子宮內膜免疫環境的變化。

有研究顯示，與正常健康妊娠婦女相比，URSA患者外周血CD4+CD25brightFOXP3+Treg減少，而Th17增加，Th17/Treg比值高于正常妊娠和未妊娠婦女[27]。此外，URSA患者外周血中Th17相關的轉錄因子RORγt表達升高[28]。有學者認為，RIF是URSA的早期表現，二者之間似存在相同的免疫調節機制[29]。因此，我們推測RIF同樣存在Th17/Treg失衡。本研究通過流式細胞術檢測發現，RIF組外周血CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值高于對照組，而CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值低于對照組(均P<0.05)，與Ghaebi等[5]的研究結果相似，這提示RIF患者存在Th17/Treg的表達失衡。因此，對于RIF患者，在排除胚胎和內膜因素異常后，可通過檢測外周血Th17和Treg比例以了解RIF患者機體是否存在二者的表達失衡，從而為RIF患者進行免疫治療提供依據。本研究通過實時熒光定量PCR檢測發現，RIF組Treg相關轉錄因子FOXP3的mRNA表達量低于對照組，而Th17相關轉錄因子RORγt的mRNA表達量高于對照組(均P<0.05)，這提示RIF患者機體Th17/Treg失衡也表現在細胞功能活性上。

研究表明，URSA患者外周血和蛻膜組織的Th17數量及其分泌的細胞因子IL-17較正常妊娠婦女明顯升高，調控Th17增殖分化的相關分子如IL-6、IL-23、RORγt的水平也相應增高[28，30]。本研究結果顯示，RIF組外周血中Treg分泌的細胞因子IL-10水平及與Treg分化相關的TGF-β1水平低于對照組，而與Th17分化相關的細胞因子IL-6、IL-23水平及Th17分泌的主要細胞因子IL-17A 水平則高于對照組(均P<0.05)，這提示在RIF患者體內低濃度的TGF-β1與高濃度的IL-6協同作用促使Th17偏移，從而形成Th17/Treg失衡的免疫環境，這與URSA的相關研究結果[6]相似。這說明RIF的發生可能與Th17/Treg失衡有關，兩者的平衡向Th17偏移，Th17通過抑制機體的免疫調節功能以增強炎性免疫反應是可能引起早期妊娠失敗的原因，因此維持Th17/Treg平衡對妊娠成功與否極其重要。

綜上所述，RIF的發生可能與Th17/Treg失衡有關，這或許可為RIF的治療提供新的依據及治療方向，以往成功治療URSA的手段也許同樣可用于RIF患者。