經皮冠狀動脈介入術后KLF5水平的變化及其在血運重建中的作用機制

曹培東 張海民

(高密市中醫院介入科，山東省淮坊市 261500)

動脈粥樣硬化是大中型動脈血管壁的多灶性改變，其特征是局部和/或全身炎癥[1]、內皮功能障礙[2]及活動性脂質堆積[3]。動脈粥樣硬化性冠狀動脈狹窄可能導致心肌梗死和心力衰竭。經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention，PCI)可提高心肌梗死患者的存活率，是臨床治療動脈粥樣硬化性血管狹窄的主要方法[4]。盡管PCI技術在不斷改進，但是PCI相關損傷導致的血管重構嚴重影響了血運重建的遠期療效。損傷后的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的過度增殖和炎癥反應是動脈粥樣硬化進展和PCI術后再狹窄的重要原因。Krüppel樣因子(Krüppel-like factor，KLF)5是KLF家族的成員之一，在心血管重構的病理生理過程中發揮重要作用[5]。正常情況下KLF5在血管系統中的表達較低，但在損傷后的VSMC中明顯升高，是應激反應與心血管重構的關鍵因素[6]。本研究探討PCI對動脈粥樣硬化性冠狀動脈狹窄患者KLF5水平的影響，并采用生物信息學方法分析與動脈粥樣硬化、血運重建相關的基因，運用染色質免疫共沉淀-高通量測序技術和實時熒光定量PCR驗證上述相關基因與KLF5的關系，探討KLF5影響血運重建的可能機制。

1 材料與方法

1.1 樣本細胞和試劑

1.1.1 臨床樣本來源：收集2019年5～8月于廣西醫科大學第一附屬醫院心臟病研究所進行PCI治療的14例動脈粥樣硬化性冠狀動脈狹窄(冠狀動脈狹窄均≥90%)患者術前和術后的血液樣本，患者均無心肌梗死、卒中、糖尿病史，均無特殊藥物服用史，其中男性12例、女性2例，年齡43～72歲。

1.1.2 細胞和試劑：人冠狀動脈平滑肌細胞(human coronary artery smooth muscle cell,HCASMC)由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。KLF5(過表達)和KLF5-RNAi(沉默表達)慢病毒購買于上海吉凱基因。免疫共沉淀-測序的測序操作由生工生物工程有限公司完成。RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT 108 reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、KLF5 ChIP抗體均購買于寶生物工程(大連)有限公司(批號：AJG2607A、AK71649A、AK81977A、2498900)。

1.2 檢測血清KLF5水平 采集患者手術前后清晨空腹靜脈血，室溫條件下待血液自然凝固15 min后，2 500 r/min離心20 min，收集上清液保存待測。采用ELISA法檢測患者血清KLF5水平，試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司(批號：ml204971)。

1.3 生物信息學分析

1.3.1 篩選目的基因：從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取與動脈粥樣硬化相關的GSE28829基因芯片數據集(該數據集資料包含13個早期和16個晚期頸動脈粥樣硬化斑塊樣本)，再利用GEO2R在線分析工具分析芯片數據，選擇校正后P<0.05且|log2FC|≥1的基因。另外，在開放訪問網站pubmed2ensembl(http://pubmed2ensembl.ls.manchester.ac.uk/)中輸入“revascularization”提取所有與血運重建相關的非重復基因。將動脈硬化相關基因和血運重建相關基因取交集，即為目的基因。

1.3.2 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡和篩選關鍵基因：使用STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)評估篩選得到的目的基因的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)信息，將得分>0.4定義為具有顯著意義[7]，并使用CytoScape 3.8.2軟件構建PPI可視化網絡[8]。利用分子復合物檢測方法篩選重要模塊基因，篩選條件為等級截止(degree cutoff)=2，k-core=2，節點分數截止(node score cutoff)=0.2，最大深度(max depth)=100。通過CytosHubba插件根據最大團簇中心性原則篩選關鍵基因，選擇最短路徑中的前6個基因進行富集分析。

1.3.3 富集分析：利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析，對涉及生物過程、細胞成分和分子功能的基因進行注釋[9]，并進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)信號通路富集分析[10]。

1.4 KLF5蛋白的染色質免疫共沉淀-高通量測序 使用甲醛把HCASMC細胞內的DNA與KLF5蛋白交聯固定后裂解細胞。從細胞裂解液中分離出基因組DNA，通過超聲處理將DNA隨機打斷為一定長度的小片段，添加KLF5蛋白特異性抗體(KLF5 ChIP抗體)，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與KLF5蛋白相結合的DNA片段沉淀下來，然后富集這些DNA 片段，并對其進行純化、文庫構建及高通量測序(均由上海生工生物有限公司完成)。最后使用IGV 2.8.13軟件對結果進行可視化處理。

1.5 實時熒光定量PCR 將KLF5和KLF5-RNAi慢病毒分別轉染HCASMC 72 h后，利用RNAiso Plus提取總RNA。利用PrimeScriptTMRT 108 reagent Kit with gDNA Eraser進行反轉錄，然后利用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ通過嵌合熒光法進行實時定量PCR。反應體系包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL、上下游引物各0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、cDNA模板2 μL、滅菌水6 μL，總體積20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；PCR反應95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,共40個循環；融解曲線分析95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。內參基因β-actin及4個關鍵基因血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM1)、整合素β2(integrin beta 2, ITGB2)、C-X-C基序趨化因子受體4(CXC motif chemokine receptor 4,CXCR4)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9) 的引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法分析各關鍵基因的mRNA相對表達水平，每個樣本均設置3個復孔，實驗均重復3次。

表1 引物序列

1.6 統計學分析 使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行作圖。采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 動脈粥樣硬化性冠狀動脈狹窄患者PCI前后血清KLF5水平的比較 14例患者PCI前血清KLF5水平為(8.33±1.52)μg/L，術后血清KLF5水平為(4.64±1.34)μg/L，術后血清KLF5水平低于術前(t=8.913，P<0.001)。

2.2 目的基因 共獲得217個與動脈粥樣硬化相關的基因，以及581個與血運重建相關的基因。取二者交集后共獲得23個重疊基因，即為目的基因，見圖1。

圖1 動脈粥樣硬化和血運重建相關基因的韋恩圖

2.3 關鍵基因與富集分析 通過STRING數據庫及CytoScape 3.8.2軟件構建PPI可視化網絡，見圖2。重要模塊基因由13個節點和45條邊組成，見圖3。根據最大團簇中心性原則篩選出6個關鍵基因，包括MMP9、CXCR4、VCAM1、ITGB2、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C型(protein tyrosine phosphatase receptor type C，PTPRC)和整合素αM(integrin αM，ITGAM)，見圖4。對6個關鍵基因進行GO分析和KEGG分析，各保留排名前兩位的分析結果，其中GO分析顯示目的基因主要參與炎癥反應、防御反應、急性炎癥反應、白細胞遷移等生物過程(見表2)，KEGG分析顯示目的基因主要通過白細胞跨內皮遷移信號通路發揮作用(見表3)。

圖2 PPI可視化網絡 圖3 重要模塊基因 圖4 關鍵基因

表2 關鍵基因的GO功能富集分析結果

表3 關鍵基因的KEGG信號通路富集分析結果

2.4 IGV可視化結合位點 KLF5的染色質免疫共沉淀-高通量測序結果顯示，ITGB2、MMP9、VCAM1和CXCR4均與KLF5存在結合位點，見圖5。這說明白細胞跨內皮遷移信號通路中的4個關鍵基因均受到KLF5的調控。

圖5 IGV軟件對結合峰的可視化結果

2.5 KLF5可調控關鍵基因的mRNA表達 KLF5-RNAi組HCASMC中的ITGB2、MMP9和VCAM1的mRNA表達水平均低于KLF5組，而CXCR4的mRNA表達水平均高于KLF5組(均P<0.05) ，見表4。

表4 轉染后兩組HCASMC中關鍵基因相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

PCI是急性心肌梗死的重要治療手段，與傳統藥物治療相比，PCI能更有效地恢復心肌灌注，減小心肌缺血或梗死面積，改善患者的臨床預后。然而，在PCI治療過程中血管壁容易受到機械損傷而發生再狹窄，再狹窄常發生在動脈粥樣硬化區，這極大地限制了冠狀動脈血運重建的壽命和有效性[11-12]。PCI相關損傷誘導的血管重構是一種復雜的病理生理反應，包括VSMC的增殖和遷移、細胞外基質的形成和新生內膜的增生。為了預防PCI術后血管再狹窄，相關領域的學者們進行了一些探索。環孢素因對T淋巴細胞具有免疫抑制作用并對VSMC增殖具有抑制作用，被證明可以預防球囊導管損傷大鼠的動脈再狹窄[13]。隨后，雷帕霉素被發現與環孢素有相似作用，臨床上便以藥物洗脫支架作為PCI后再狹窄的預防手段[14]。然而到目前為止，除了藥物洗脫支架，解決PCI后再狹窄的方法有限，尤其是對于復發的支架再狹窄。

KLF5是多個細胞周期蛋白的調控因子，可激活細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E進而促進基因的轉錄和抑制細胞周期負調節因子p21的表達，進而促進VSMC增殖。KLF5也是調節VSMC表型的重要因子，其過表達可促進VSMC從收縮表型轉變為增殖表型，從而促進動脈粥樣硬化和血管再狹窄的發生[15-16]。研究表明，含有KLF5陽性細胞的人類冠狀動脈標本比不含KLF5陽性細胞的人類冠狀動脈標本具有更高的再狹窄風險[17]。本研究結果顯示，14例動脈粥樣硬化患者PCI后血清KLF5水平低于術前(P<0.05)。說明PCI后KLF5的降低可能與血運恢復后解除了冠狀動脈缺血缺氧的狀態有關。最新研究表明，缺氧會誘導肺動脈平滑肌細胞KLF5的表達[18]，并可通過缺氧誘導因子1α介導缺氧性肺動脈高壓的血管重構[19]。這意味著PCI后的KLF5水平可能與血運恢復的程度呈負相關。

本研究的生物信息學分析結果表明，與動脈粥樣硬化、血運重建相關的23個目的基因主要通過白細胞跨內皮遷移信號通路參與炎癥反應、防御反應、急性炎癥反應、白細胞遷移等免疫反應相關生物過程。白細胞通過靜脈壁遷移是一種基本的免疫反應，啟動了白細胞在靜脈壁的極化運動，受刺激的血管內皮細胞將出現一過性的屏障破壞[20]。因此，不受控制的白細胞跨內皮遷移會加劇動脈粥樣硬化的進展[21]。已有研究表明，降低KLF5表達可抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應，減緩動脈粥樣硬化的進展[22]。研究顯示，VSMC特異性KLF5基因敲除顯著降低了血管組織中炎癥細胞因子腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β的表達[23]。本研究通過IGV軟件分析發現，與血運重建相關的關鍵基因ITGB2、MMP9、VCAM1、CXCR4均受KLF5的直接調控；實時熒光PCR結果表明，降低KLF5可以抑制HCASMC中ITGB2、MMP9、VCAM1的表達，促進CXCR4的表達。已有研究表明，ITGB2、MMP9、VCAM1能夠促進炎癥反應，從而加重動脈粥樣硬化[24-26]，而CXCR4則通過抑制炎癥反應、保護內皮屏障功能、維持動脈完整性和VSMC收縮表型來限制動脈粥樣硬化進展[27-28]。因此，PCI術后，隨著KLF5的降低，受其調節的血運重建相關性基因均發揮了抑制動脈粥樣硬化炎癥反應的作用。

綜上所述，KLF5的降低有利于抑制PCI后的血管異常重構，其可能通過調節白細胞跨內皮遷移通路的相關因子抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應。PCI后血清KLF5水平或可反映血運恢復程度，因此KLF5可能是判斷PCI預后的標志因子，并有望成為預防和治療PCI后再狹窄的新靶點。