富血小板血漿凝膠促進大鼠深Ⅱ度燒傷創面愈合的機制研究

皮膚作為人體最大的器官，具有分泌汗液、排泄廢物、維持體溫、防止病原體入侵等多種功能

。皮膚的結構主要由表皮、真皮層和皮下組織組成。由火、熱水或蒸汽引起的深部皮膚損傷在臨床上常見。這些患者容易感染和代謝失衡，有時導致截肢甚至死亡

。因此，找到一種有效的解決方法，盡快愈合此類創面，顯得尤為重要。富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）是全血經過二次低速離心分離而得到的血小板和血漿濃縮物，包含紅細胞、白細胞和生長因子等物質,并已在頜面外科、心臟外科、整形外科、運動醫學等領域取得了良好的治療療效

。大量臨床數據表明，燒傷患者采用自體富血小板血漿凝膠治療可以提高燒傷創面愈合率、減少創面愈合時間、減輕創面疼痛、改善愈合質量

。目前關于富血小板血漿凝膠促進燒傷創面愈合的相關機制尚不明確。本實驗旨在通過建立大鼠深Ⅱ度燒傷模型，采用富血小板血漿凝膠治療，通過觀察創面愈合情況，炎癥細胞和炎癥反應、巨噬細胞表型的變化，初步探究富血小板血漿凝膠促進燒傷創面愈合的作用和可能機制。為富血小板血漿在燒傷創面治療方面提供實驗理論數據。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑與儀器：凝血酶購自Sigma公司，PerfectStart Green qPCR SuperMix購自全式金公司、RNase inhibitor、dNTPs、RevertAid Reverse Transcriptase購自Thermo公司、TNF-α、IL-10、TGF-β

、PCR引物購自上海生物工程公司、iNOS抗體及CD206抗體、羊抗兔IgG二抗購自Servicebio公司。實時熒光定量PCR儀（ABI Q1）、PCR儀（北京東林昌盛科技有限公司）、切片機（萊卡）、包埋機（萊卡）、顯微鏡（尼康）、低溫高速離心機（德國Thermo公司）。

1.2 實驗動物：6～8周齡雄性SD大鼠，平均體重180～220 g，購自濟南彭悅實驗動物繁育有限公司[動物合格證：SCXK(魯)20190003]，飼養在青島大學附屬醫院SPF實驗室[SYXK(魯)20150003]，并在安靜，通風、恒溫的環境下飼養，相對濕度50%，12 h光暗交替。獨籠飼養，自由進水，喂食大鼠原用飼料，定時更換墊料。本實驗經青島大學附屬醫院實驗動物倫理委員會審核、批準。

1.3 燙傷模型的建立：大鼠適應性飼養1周后，將大鼠背部皮膚剪毛，用苯巴比妥（3.5 ml/kg）腹腔麻醉后，將小鼠置于俯臥位，將四肢固定在大鼠固定板上，使背部皮膚較平坦。室溫（20℃～25℃）下，將帶有刻度的兩端無堵頭、內直徑約2.8 cm的中空塑料管直立于大鼠背部，其一端與大鼠備皮處皮膚緊密接觸，另一端向管內注入沸水(約97℃～100℃)至2 ml刻度線處，沸水與皮膚持續接觸約8 s后，立刻將沸水倒出。隨后給予大鼠腹腔內注射5 ml復方氯化鈉注射液抗休克，待大鼠蘇醒。燙傷深度經24 h后病理驗證。

1.4 富血小板血漿凝膠制備：另取SD大鼠12只，嚴格執行無菌操作，腹主動脈取血10 ml，采用二次離心法，第一次以200 g，4℃條件下，離心15 min，取全部上清液及交界層以下3 mm移至另一離心管，搖勻，第二次以500 g，4℃條件下，離心10 min，棄上層約3/4的貧血小板血漿，剩下1/4下層為少量紅細胞、血漿、血小板混合物約1 ml為PRP。按體積9:1的比例加入凝血酶1 000 U/ml的激活劑，室溫下5～6 s成凝膠狀態。

2.1 深Ⅱ度燙傷模型建立：正常皮膚光鏡下觀察皮脂腺、毛囊結構完整，皮膚層次清晰，排列有序呈編織狀。燙傷后24 h病理切片顯示大鼠皮膚結構不清，壞死，真皮層膠原纖維變性，部分皮膚附屬器的細胞發生核固縮，偶見殘存毛囊，皮膚與皮下組織分離明顯，創面毛細血管擴張，管腔內可見紅細胞及血液瘀滯。符合深Ⅱ度燒傷的病理組織學改變，表明本次深Ⅱ度燒傷模型造模成功。見圖1。

1.5 分組及給藥：將建模成功的大鼠隨機分為兩組，實驗組、對照組各9只大鼠。實驗組采用PRP凝膠涂抹，范圍大于創緣2 mm，厚度0.5～1 mm，均勻涂抹后再用凡士林紗布固定，每個創面約0.2 ml，隔日換藥1次。對照組予以生理鹽水清洗創面后，凡士林紗布覆蓋創面，再用敷貼固定，正常飼養共14 d。分別于治療后第3、7、14天，每組隨機選取3只大鼠，CO

窒息處死后，創面加標尺垂直拍照，創面組織取材。

1.6 動物大體觀察及愈合率計算：照片采用Image pro plus 6.0圖像處理軟件統計創面面積。按以下公式計算愈合率。創面愈合率（%）=（原始創面面積-當天創面面積）/原始創面面積×100%。

1.1 0 統計學分析：SPSS 22.0軟件分析實驗數據，計量資料采用均數±標準差表示，行

檢驗，

＜0.05為差異具有統計學意義。

再次，不僅語境是分析文學作品語言特色的關鍵性因素，而且，作者的寫作個性也是說明其語言特色的關鍵所在。但這一點卻被大多數的研究者所忽視。因為，一個作者的創作風格，不僅體現其小說創作的選材里，體現在小說人物形象體系的設計中，而且還體現在其創作的重要媒介——語言運用上。在小說《警察和贊美詩》中，作者的修辭運用別具特色。例如：

1.9 qPCR檢測：取治療后第3、7、14天創面組織，采用qPCR技術檢測炎癥反應相關因子TNF-α及抗炎相關因子IL-10、TGF-β

的表達。使用Trizol法提取各組創面總RNA，反轉錄為cDNA后，按照SYBR GREEN 1MIX說明書順序加入反應試劑、引物及cDNA，進行PCR反應。采用2

法計算目的基因相對表達量，以GAPDH做為內參。各基因引物序列見表1。

六是加大了對口幫扶的力度。組織上海、江蘇、浙江、山東對口幫扶云南，北京、天津、湖北、安徽對口幫扶貴州，廣東、福建對口幫扶廣西，并從七大流域機構和部直屬科研單位抽調140多名水文地質、物探、水工等方面的專家指導抗旱，調集50多臺（套）鉆機、地質探測儀、泥漿泵等設備運赴重旱區找水打井。

1.8 免疫組織化學分析：取治療后第3、7、14天組織切片，經脫蠟至水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉、后切片用iNOS(1:1 000)標記M1型巨噬細胞，CD206（1:500）標記M2型巨噬細胞，4℃過夜孵育，PBS洗劑3次，二抗山羊抗兔（1:300）室溫孵育50 min，最后DAB顯色并蘇木素復染細胞核，于400倍鏡下觀察iNOS，CD206的表達。圖像中棕色或棕黃色的為陽性細胞，每張片子隨機取5個視野，計數陽性細胞數，取均值。

1.7 炎癥細胞的半定量分析：治療后第3、7、14天，各組創面組織PBS沖洗后置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片，片厚4 μm。HE染色。于400倍鏡下隨機選取5個視野，每張圖片計數藍色深染的炎性細胞（單個核，圓形細胞），取5張圖片炎性細胞數的平均值。同樣方法得到第7、14天各組炎癥細胞平均值。

2 結果

該類維修集約范式的維修主體為城市軌道交通車輛運營單位，突出特征為“自主”。即，城市軌道交通運營單位成立相應的機構或獨立實體，自身承擔車輛質保期后的維修活動。該維修集約范式最大的優點在于責任界定清晰，維修保障響應比較及時。缺點在于城市軌道交通運營公司要負責投入人力、物料等維修資源。

2.2 PRP凝膠對創面愈合率的影響：結果顯示，治療后第3、7、14天，兩組大鼠的創面愈合率均隨著觀察時間延長而升高，實驗組創面愈合率顯著高于對照組，差異具有統計學意義（

＜0.05）。PRP凝膠可促進大鼠燙傷創面的愈合，且創面炎癥反應及組織液滲出均明顯好于對照組，見圖2，表2。

只得慰藉于蘇珊娜與浮西努相同的身世，神似的氣質，假借戰爭的苦難造成人物情感的偏執走向，并且借弗希里的口：“人在最無助的時候，愛情最容易入侵。在最危險的時候也是，這像嗜酒一樣。”

2.3 對創面炎癥細胞的影響：鏡下觀察可見，在治療后第3、7、14天，兩組創面炎癥細胞均呈減少趨勢，對照組創面可觀察到更多的炎癥細胞。實驗組炎癥細胞數顯著低于對照組，差異具有統計學意義（

＜0.05）。見圖3，表3。

“他們夫妻之間吵架，和你有什么關系？”我父親說著抓住了我的袖管，要把我往書房里拉，我拒絕進父親的書房，我說：“他們打起來了……”

2.4 免疫組化結果：鏡下觀察兩組創面組織中，iONS陽性細胞胞質部分棕黃色深染，治療后第3，7，14天，兩組iNOS陽性細胞（M1型巨噬細胞）逐漸減少，但實驗組明顯比對照組少，差異具有統計學意義（

＜0.05）。鏡下觀察兩組創面組織中，CD206陽性細胞胞質棕黃色深染，治療后第3，7天，兩組CD206陽性細胞（M2型巨噬細胞）逐漸增多，治療后第14天兩組創面陽性細胞數目較前有所減少，實驗組陽性細胞數目明顯多于對照組，差異具有統計學意義（

＜0.05）。見圖4～5，表4。

2.5 qPCR檢測結果：治療后第3、7、14天實驗組創面組織TNF-α mRNA相對表達量持續降低，在各個時間段，實驗組TNF-α mRNA相對表達量顯著低于對照組，差異具有統計學意義（

＜0.05）。IL-10 mRNA相對表達量則持續升高，在各個時間段，實驗組均高于對照組，差異具有統計學意義（

＜0.05）。實驗組TGF-β

mRNA相對表達量在第3天升高，實驗組高于對照組，差異具有統計學意義（

＜0.05）；在第7天實驗組TGF-β

mRNA表達量低于對照組，差異具有統計學意義（

＜0.05）；在第14天TGF-β

mRNA表達明顯下降，實驗組TGF-β

mRNA表達量低于對照組，差異具有統計學意義（

＜0.05）。見圖6。

3 討論

燒傷創面的愈合過程復雜，在其愈合過程，需要細胞之間、細胞與細胞外基質及細胞因子間相互影響和相互協同。傷口部位的炎癥反應是影響愈合的重要決定因素。與非燒傷創面的愈合過程相比，燒傷創面愈合較晚，炎癥細胞因子水平較高，血管生成較差，基質沉積較少

。

PRP可以通過分泌生長因子、細胞因子、趨化因子等炎癥介質以及趨化因子的表達調節創面的炎癥反應

。激活的PRP表現出良好的促炎因子和抗炎因子的平衡，并通過調節損傷部位的主要炎癥細胞（中性粒細胞和巨噬細胞）的分泌和招募，推動創面炎癥反應的進程，促進創面炎癥期盡快結束轉向增殖期和重塑期

。本研究中炎癥細胞計數結果表明，與對照組相比，激活的PRP凝膠可明顯減少創面炎癥細胞浸潤，預防炎癥狀態持續，使創面盡快進入修復狀態。

燙傷后的創傷修復初期，創面局部皮膚組織因創面微循環障礙和過度炎性反應，導致TNF-α等因子水平提升，微循環障礙又可導致局部炎癥因子和代謝產物堆積，導致創面炎癥加重

。TNF-α的升高不僅導致肉芽組織的生成減少，還抑制TGF-β對細胞外基質刺激的產生。PRP可通過抑制促炎信號通路和釋放抑炎因子，從而抑制過度的炎癥反應，促進創面愈合

。PRP中含有中性粒細胞可激活蛋白-2、基質細胞衍生因子-1α等抑菌因子及白細胞、單核細胞等血細胞成分，上述成分均在機體抗炎及增強免疫方面具有重要作用，可增強機體對炎癥的控制而降低各炎癥因子的表達水平

。PRP還可通過微小RNA-21/PDCD4/核因子κB信號通路減少促炎因子TNF-α的表達，提高抗炎因子IL-10、TGF-β

水平而發揮直接抑制炎癥作用

。本實驗檢測表明燙傷后隨著愈合時間延長，各組TNF-α mRNA的表達水平逐漸降低，實驗組TNF-α mRNA的表達水平顯著低于對照組。相反創面抗炎因子IL-10 mRNA升高，表明經過PRP凝膠治療后，燙傷創面促炎因子和抗炎因子的表達譜發生轉變，將細胞因子由促炎譜向抗炎譜轉變。TGF-β是一種多功能細胞因子,不僅具有抗炎作用，而且可以誘導成纖維細胞增殖和細胞外基質成分的合成，導致組織纖維化

。本研究結果發現PRP凝膠可能通過在前期提高TGF-β

表達，促進創面愈合，治療后期表達的下降可使瘢痕組織形成風險下降。

(1)尾砂粒度及成分組成。尾礦庫中尾砂按粒度劃分，以粉砂為主，平均粒徑d50=0.04～0.1 mm，加權平均粒徑dp=0.05～0.15 mm，不均勻系數Cu=3～4，粘粒含量1%～5%，局部大于20%。尾砂物質主要成分是石英，其次是難選鐵氧化物，再次是少量的綠泥石和碳酸鹽類礦物。

在皮膚傷口愈合過程中，活化的巨噬細胞是炎癥反應的主要參與者和傷口修復的關鍵調控因子，并對創面其他細胞的功能及狀態產生影響

。創面中的活化巨噬細胞主要為兩種極化狀態，M1（促炎性）和M2（抗炎性），在炎癥期，M1型巨噬細胞以促進創面炎癥為主，分泌大量的炎癥及促炎癥因子TNF-α，IL-1，IL-6和iNOS,主要作用是吞噬凋亡的細胞殘片、細菌及異物，同時調節淋巴細胞、樹突狀細胞等免疫細胞的炎癥功能，在增殖和重塑期以M2型巨噬細胞為主，高表達抗炎因子IL-10以及多種生長因子TGF-β

，VEGF和PDGF，刺激成纖維細胞、角質形成細胞和內皮細胞分化、增殖和遷移，促進膠原沉積、促進血管化和肉芽組織增生促進組織重建

。燙傷后創面的巨噬細胞偏向M1型，在創面發生感染或創面條件不可控時，巨噬細胞炎性反應就會增強,從而加重燙傷程度，延遲創面愈合

。Kim等發現PRP能降低核因子-κB（NF-κB）的轉移活性，而NF-κB則是巨噬細胞向M1型極化過程中重要的調控因子

。陳瀟通過體外實驗推斷出PRP可能不僅依賴PRP本身所含的大量生長因子，它還可以激活JAK1/3-STAT6通路促進巨噬細胞向M2型轉化，通過調節巨噬細胞的活化狀態以促進創面愈合

。劉宸發現PRP能聚集并趨化大量巨噬細胞向非炎癥表型分化，抑制炎性因子表達，促進抗炎性因子表達

。本研究結果顯示，治療后第3、7、14天，實驗組M1型巨噬細胞數量均少于對照組；治療后第3、7、14天，實驗組M2型巨噬細胞數量均多于對照組，因此筆者認為，PRP可以促進燙傷創面中的巨噬細胞從M1型向M2型轉化，進而促進創面的愈合，與之前研究結果相一致。

綜上所述，PRP凝膠可有效促進大鼠深Ⅱ度燒傷創面愈合，可能與減少創面炎癥細胞浸潤，調節創面炎癥反應及巨噬細胞表型有關。其促進創面愈合的機制仍需進一步研究。

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