單分子生物檢測方法及應用研究進展

周文超 ，李政昊,2?，武 杰,2

（1. 中國科學院 長春光學精密機械與物理研究所 應用光學國家重點實驗室, 吉林 長春 130033；2. 中國科學院大學, 北京 100049）

? 共同第一作者

1 引 言

單分子是探索生物性質過程的最小單元。對單分子的研究有助于發現生物系統中時間和空間的異質性，以及觀測生物分子的潛在機制。單生物分子主要包括蛋白質、核酸、病毒和生物小分子等，高靈敏度檢測可以量化單個生物分子，在臨床診斷和探索潛在疾病等應用上，起到至關重要的作用。目前被廣泛使用的單分子檢測方法包括表面等離子體共振(SPR)，光波導光柵(OWG)，生物層干涉法(BLI)，酶聯免疫法(ELISA)、聚合酶鏈式反應(PCR)和質譜分析法等，用于定量檢測患者樣本中的生物分子水平，檢測結果對評估患者的健康狀況和規劃治療方案非常重要。然而，血液、唾液或其他生物體液中許多潛在、起到決定性作用的蛋白質、核酸或生物標志物的濃度遠低于當前方法的檢測限，因此需要開發檢測限更低的技術。具有在臨床樣本中測量低濃度生物標志物的能力，就可以通過無創或微創的方式提前發現疾病。因此，需要超靈敏的分析技術來檢測和分析當前無法檢測到的重要生物標志物。

單分子生物檢測技術在低濃度蛋白、核酸和其他生物相關分子的超靈敏分析方面具有巨大的應用潛力。與傳統方法檢測生物分子整體平均值不同，單分子檢測方法可以測量到單個生物分子層次。核酸作為生命的基本分子之一，具有儲存、傳遞和表達遺傳信息的能力，也與各種臨床疾病密切相關，已成為臨床診斷和治療的重要依據。在核酸檢測方面，該技術準確性高，可以直接識別堿基，實現核酸的長讀取，從而發現新發致病結構變異。蛋白質分子在生物體中執行許多重要的任務，包括代謝催化、DNA 轉錄和復制、信號轉導和分子運輸等。在蛋白質與多肽檢測方面，單分子生物傳感器除了具有高靈敏度、特異性和選擇性外，顯示的分析時間更短，這使得臨床環境和新的藥物研發中的矩陣高通量分析成為可能。除了蛋白質和核酸，單分子檢測還可以應用于在代謝途徑、臨床診斷和藥物中發揮不同作用的小分子，發現活細胞中的個體異常，量化人體中含量極低的生物小分子，對解決生命科學中許多長期存在的問題具有十分重大的意義。

2 發展、分類及應用

霍爾于1956 年用透射電子顯微鏡（EM）拍攝到第一張單生物分子圖像，包括脫氧核糖核酸（DNA）分子和膠原蛋白等生物分子，對細胞潛在過程的生物學機制研究有了實質性的突破[1]。1961 年，斯坦福醫學院的Rotman 教授第一次實現單分子檢測，他將含有β-半乳糖苷酶和熒光底物的混合溶液噴在硅油上，在油中產生液滴，每個液滴中含有0 個或1 個酶分子，經過數小時的等待，能夠通過觀察發出熒光的液滴來檢測和測量出單個酶分子的存在[2]。隨后，研究人員將膜片鉗用于單分子的相關研究，為離子通道蛋白檢測奠定了基礎[3]。早在1976 年，Hirschfeld開始進行光學單分子檢測的相關研究，使用異硫氰酸熒光素的80～100 個分子對20 000 kDa 聚乙烯亞胺進行標記，然后將這種高熒光聚合物與γ-球蛋白結合，使用全內反射顯微鏡，用高強度激光檢測單個蛋白質分子。在完全光漂白之前最大化熒光信號（當時的探測器性能較現在的集成探測器略差，這樣做可以盡可能多地收集光子），根據已知的分子濃度進行檢測，觀察熒光檢測的預計數量[4]。這次實驗非常重要，因為它是首次不使用酶的單分子測量，也是第一個使用全內反射進行單分子檢測的研究。1988 年，Gelles 等人通過對計算機圖像進行數字化處理，發現塑料珠可以在其中心的驅動蛋白馬達驅動下，實現精度為納米尺度的旋轉[5]。在1990年，Orrit 和Bernard 首次檢測到一個并五苯分子的熒光信號[6]。此后，隨著熒光探針和超分辨率顯微鏡的發展，科學家們解決了許多復雜生物系統、多相催化、生物分子相互作用、酶系統和實時構象變化等長期存在的問題。1997 年首次將表面增強拉曼光譜（SERS）技術應用于單分子檢測，為化學分析提供了一種前所未有的高含量、超靈敏的光學方法[7]。1998 年，謝曉亮團隊首次利用熒光顯微鏡實時觀察到單個酶蛋白分子的催化循環過程。這項研究成果成為單分子酶學的里程碑，成為單分子DNA 測序技術的核心技術[8]。Vgelstein 與Kinzter 于1999 年發表了采用數字PCR(digital PCR)方法定量檢測結腸癌患者糞便中的微量K-RAS 基因突變的成果[9]。2006 年，首臺數字式單分子免疫陣列蛋白分析儀Simoa HD1 面世。該檢測平臺由光纖微陣列技術和單分子檢測技術構成，可進行單分子酶分析。2012 年，紐約冷泉港實驗室的研究人員將Pacific Biosciences 單分子測序技術與Illumina 公司的傳統測序技術相結合，用于修正單分子測序中的錯誤，結果表明該方法顯著提高了測序結果的準確性[10]。布羅德研究所張鋒團隊于2017 年研發出一種全新的CRISPR 應用工具（SHERLOCK 系統）。該CRISPR 系統對于RNA 和DNA 的檢測靈敏度均可達單分子級[11]。

2.1 納米孔的單分子生物檢測

在過去的幾十年里，基于納米孔的檢測方法在許多學科和領域起到關鍵作用，包括生物醫學、納米尺度化學、生物物理學等。納米孔單分子生物檢測傳感器由一個直徑在1～100 nm 之間的孔，嵌入到或形成于兩個含有電解質溶液的腔室的絕緣膜中，在外加電場作用下，離子自由流過納米孔，形成穩態離子電流。在檢測過程中，帶電分子（核酸、多肽、蛋白質、聚合物分子等）阻塞納米孔，導致孔隙離子電流下降，分子通過納米孔后，電流會恢復正常，分子在納米孔中通過產生的電信號可傳達出生物分子的尺寸、濃度、結構等信息。待測生物分子的尺寸與納米孔尺寸越接近，從孔隙通過產生的離子電流信號波動越明顯[4]。納米孔單分子傳感器每次只通過一個待測分子，表現出對單一個體的極強靈敏度。此外，納米孔檢測技術具有重復性高、操作簡單、成本低、有助于理解單分子行為等優點。納米孔包括生物納米孔與固態納米孔兩類，都可進行單分子層次的生物檢測。

2.1.1 生物納米孔

生物納米孔的優點是具有良好的三維結構和高復現性。常用的生物納米孔包括α 溶血素[12]、恥垢分枝桿菌孔蛋白A(MspA)[13]、氣溶素(AeL)[14]、Fragaceatoxinc (frac)納米孔[15]等，也可由雙層膜中的生物合成或固相合成的小肽（小于100 個氨基酸的肽）產生，研究人員還通過軟件設計出由DNA鏈構成的DNA 折紙納米孔，可以控制納米孔結構尺寸[16]。生物納米孔也稱為跨膜蛋白通道，第一個用于單生物分子檢測的納米孔是α 溶血素。其孔通道寬度只可以通過單鏈DNA，雙鏈DNA尺寸過大無法通過，從而實現了對單鏈DNA 的檢測[17]。隨著研究的深入，生物納米孔也用于癌癥生物標志物、對映異構體、miRNA、多肽與蛋白質等分子的傳感。弗吉尼亞大學相關研究團隊研發了一種基于光譜的單分子納米孔用于表征水溶性肽。這項技術的基礎原理是利用生物蛋白的納米孔分解不同大小的分子，利用Au25(SG)18團簇來改善聚乙二醇(PEG)的檢測結果，增加多肽對孔的開啟和關閉率（如圖1所示）。同時，溶劑/溶液的pH 值對提高多肽的活性也有重要作用，在單分子檢測中表現出相應的信號波動[18]。

圖1 （a）陰離子Au25(SG)18 團簇增強納米孔檢測示意圖及（b）相應的電流強度[18]Fig. 1 (a) Schematic diagram of the anionic Au25(SG)18 cluster-enhanced nanopore detection and (b) it"s corresponding current traces[18]

2.1.2 固態納米孔

固態納米孔較生物納米孔表現出更強的魯棒性，制備方法可與傳統半導體制造工藝兼容，也可以與微流體及光學檢測方法集成。控制其孔隙幾何形狀，使其與生物分子相匹配。在電解質中施加電壓，使帶電的生物分子在電泳力作用下通過納米孔，可以提高易位過程中產生的離子電流閾值，并最大限度地提高信噪比[19]。

在納米孔為主體的檢測系統中，孔徑無法通過以光傳播的方式進行檢測的納米孔稱為零模波導（ZMWs）。ZMWs 通常由金屬鋁制成，置于透明襯底上，并要降低背景熒光。對于孔徑小于光波長的金屬納米孔，即光波無法通過，但生物分子仍能通過的孔隙，將待測生物分子進行熒光標記。在一定的光照下，金屬膜上方的熒光分子層被金屬膜屏蔽，因此，只有位于孔底部的熒光團能產生可檢測的信號（如圖2 所示，彩圖見期刊電子版）。零模波導多用于DNA 和蛋白質生物分子的檢測以及單分子的生物物理學研究等[20]。

圖2 不同材料架構的零模波導（ZMW）等離子體納米孔[20]。（a）深紫外等離子體增強Al ZMW 單蛋白自身熒光。（b）用于增強單分子探測的Au-Si 零模混合波導。（c）等離子體納米孔器件結構增強單分子熒光檢測，該結構由金膜制備的納米孔和獨立式氮化硅膜制備的納米孔組成。Fig. 2 Various material framework of zero-mode waveguide (ZMW) plasma nanopore[20]. (a)The autofluorescence of Al ZMW monoprotein was enhanced by deep ultraviolet plasma. (b) Au-Si zero-mode hybrid waveguides for enhanced single-molecule detection. (c)The plasma nanopore device structure enhances single-molecule fluorescence detection,which consists of nanopore prepared by gold film and nanopore prepared by independent silicon nitride film.

以ZMWs 為基礎，目前普遍使用金代替鋁，使其產生強的等離子體共振效應。等離子體與固態納米孔檢測技術集成，在靈敏度、特異性、陣列檢測、持續時間等方面有所提升。在等離子體納米孔周圍的電磁場起到增強光學光譜、提高熒光標記分析物信號、實現分子和離子在傳感器之間熱遷移的作用。高限制的等離子體場可用于增強標記了適當熒光染料的生物分子的熒光能量（FE）和熒光共振能量轉移（FRET）[21]。利用等離子體納米孔技術對電磁場進行限制，可以對背景熒光產生很強的抑制作用，同時將FE 凈增強10 倍以上。

2.1.3 相關應用

2.1.3.1 核酸檢測

納米孔核酸檢測讀取長度不受限制，小型化納米孔核酸檢測儀器可用于實時檢測。通過單分子檢測，直接進行核酸讀取，不需要進行擴增的方法被稱為第三代測序。納米孔核酸檢測利用DNA穿過孔時，產生的電荷變化來識別不同的核酸[22-23]。對于臨床樣本，一般利用雜交原理構建的生物傳感器的靈敏度和選擇性存在缺陷，由于血清中存在其他各種蛋白和非靶核酸，可導致離子電流阻滯干擾靶信號等問題[24]。納米孔核酸檢測的難點之一是控制DNA 鏈通過納米孔的易位速度，時間過短會導致采集到的電流特征信號無法被記錄或記錄錯誤。研究人員發現對于生物納米孔可以在待測DNA 分子入口處使用分子馬達，如DNA聚合酶或解旋酶，可以顯著降低DNA 的移動速度，并在核酸水平上精確控制DNA 移動[25]。DNA鏈中相鄰核酸之間的長度只有0.5 nm，膜的厚度了決定測序的分辨率，更薄的厚度可使識別更加準確，隨著石墨烯材料的出現，發現其厚度與核酸之間間距相當，具有很高的空間分辨率，并且具有高機動和柵可調載流子的電子導電性，可應用于納米孔單分子檢測[26]。氮化硅作為一種可靠的半導體相關材料，使用氮化硅薄膜制造納米孔更適合大規模生產，目前發現的最短有效厚度約為1.7～1.8 nm，大約可容納4 個連續的核酸[27]。Burck等人最近提出了一種基于納米孔的生化分析方法。其利用納米孔中的光電傳感技術對小的外周血循環中的游離DNA 片段進行定量分析，證明小鼠血液中特異性檢測ERBB2 S310F 和PIK3CA H1047R 的基因突變[28]。

2.1.3.2 蛋白質與多肽檢測

蛋白質與多肽都是由氨基酸組成的。與DNA測序不同的是，納米孔技術無法對蛋白質或多肽的每個氨基酸進行測序，所以研究人員把精力集中在區分單一氨基酸上。單氨基酸檢測靈敏度與分子通過納米孔的易位速度相關，Yuan 等人使用未修飾的氣溶膠納米孔與待測氨基酸之間的氫鍵成功檢測出單個半胱氨酸[29]。為了檢測單氨基酸分辨率下的多肽，研究人員將不同分子量的多肽用不同阻滯信號幅度加以區分，Piguet等人在單氨基酸分辨率下對混合溶液或獨立的均荷電短同肽(5～10 個氨基酸)進行了大小區分。在這項研究中，氣溶膠納米孔是完全未經修飾的，可以正確區分不同長度的多肽[30]。2019年，Matteo Dal Peraro 課題組以納米孔單分子檢測技術為基礎，對氣溶素的離子選擇能力與傳感能力展開研究。因為氣溶素與其他生物納米孔的區別主要在于其孔徑長度，研究發現其能力主要由靜電和雙β-桶的最狹小部分直徑控制，較長的孔與直徑較小的孔徑相結合可使分子的易位變慢，可實現對多肽分子更高精度的檢測[31]。2021 年，荷蘭格羅寧根大學的Giovanni Maglia 教授通過低pH 條件以及在孔道內引入芳香族氨基酸突變的方法，提高了多肽在納米孔中的停留時間、捕獲頻率和分辨率，同時對納米孔的多肽傳感機制做出一定驗證，為納米孔的多肽檢測提供了一種切實可行的方法[32]。同年，為了促進蛋白質納米孔的實際應用，LI M Y 團隊通過納米孔實驗與分子動力學模擬，實現了高度特異的離子電流強度對待測物體積差分辨（如圖3 所示，彩圖見期刊電子版）[33]。

圖3 通過野生型氣溶膠膜通道運輸C-A3 和mC-A3[33]。（a）氣溶膠納米孔模型。氣溶素（灰色）嵌入脂質雙層膜（深藍色），核苷酸（紅色）放置在孔的入口；（b）含有甲基胞嘧啶和胞嘧啶的甲基化和非甲基化寡核苷酸結構。紅色部分為添加的甲基部分Fig. 3 Transporting C-A3 and mC-A3 through a wild-type aerolysin membrane channel[33]. (a) All-atom model of the fulllength aerolysin nanopore system. Aerolysin (gray) was inserted into a lipid bilayer membrane (dark blue), while nucleotides (red) were placed at the entrance of the pore. (b) Structure of methylated and unmethylated oligonucleotides containing methylcytosine and cytosine, respectively. The only difference between them was the addition of a methyl group which is marked in red

2.2 數字式單分子生物檢測

數字式單分子生物檢測通過將待測分子以統計學原理分離出“有”與“無”兩種狀態，對“有”的分子進行計數，獲得待測分子數量。與批量檢測方法相比，數字式單分子生物檢測系統在對蛋白質和核酸的測量上具有明顯優勢。在批量測量中，待測物的濃度與信號強度成比例，樣本總體的特異性被忽略，只能測量平均活性。與整體檢測相比，數字式檢測與信號強度無關，讀取單個信號的有無并進行計數[34]。數字式單分子生物檢測將單個帶有熒光底物的酶分子加載到飛升體積大小的微孔中，在微孔中每個酶分子都能催化大量底物使其轉化為熒光分子，產生較高的局部濃度，觀測含有熒光信號的微孔，計算酶分子的數量。以微磁珠為載體將待測生物分子與熒光底物捕獲到單個飛升體積大小的微孔或微反應器中，對微孔陣列中每個孔中的熒光信號同時進行數據采集，通過增加微磁珠被捕獲的概率檢測濃度極低的待測分子（如圖4 所示，彩圖見期刊電子版）[35]。

圖4 微磁珠加載示意圖[35]。（a）使用磁力和親-疏水微孔陣列高效加載微磁珠。（b）直徑、間距和深度不同的微孔陣列在多次循環下的加載率。（c、d）40 倍顯微鏡下加載前后的亮場顯微圖像。（e）100 倍顯微鏡下加載后的亮場顯微圖像Fig. 4 Magnetic bead seeding[35]. (a) Schematic of the magnetic bead seeding on HIH microwell arrays. (b) The bead distribution in arrays with varying well diameters, array pitches and well depths, for multiple-seeding cycles. (c,d) ×40 magnification bright field microscopy image of a microwell array before and after magnetic bead seeding, respectively. (e)×100 magnification bright field microscopy image of a microwell array after seeding

Rissin 課題組提出以微珠為載體的ELISA 單分子陣列檢測方法，使檢測過程更加穩定，可實現單個蛋白質分子的檢測[36]。首先使用單個蛋白分子被結合抗體的微珠捕獲，攜帶蛋白分子的微珠遵循泊松分布的百分比，即每個珠粒結合一個或零個目標分子，與加入生物素化的檢測抗體形成三明治式免疫復合物，然后用鏈霉親和素結合的β-半乳糖苷酶進行標記，將微珠與熒光底物共同加入到與微孔尺寸相匹配的微孔陣列中，即每個微孔最多存在一顆微珠（如圖5 所示）[37]。通過這種方法，可以使捕獲的單個蛋白分子被分離在獨立的孔中。微孔封閉后，通過觀察微孔上的熒光數量計算單目標分子。每個單獨的微反應器在這個過程中起到分散待測分子，數字化檢測目標的作用。蛋白質濃度是通過測量同時含有珠粒和熒光產物的孔數與含有珠粒的孔總數的比率來確定的。該方法大大降低了檢測抗體和酶的使用量，也減少了與微珠的非特異性結合，降低了背景噪聲。因此，數字式單分子生物檢測方法的檢測限比傳統ELISA 低1 000 倍。

圖5 數字ELISA 示意圖[37]。（a）抗體結合微珠捕獲單個目標生物分子，然后由另一個與標記抗體結合的抗體檢測。將微珠裝入飛升微孔陣列中用于分離和檢測單個分子。（b）產生單分子信號的飛升微孔陣列的一部分熒光圖像。大多數飛升體積微孔含有一顆微珠，但這些珠中只有一小部分具有催化酶活性，表明是一種單一的結合蛋白。（c）蛋白質在本體溶液中的濃度與結合蛋白質分子的微珠的百分比關系Fig. 5 Schematic representation of digital ELISA[37]. (a) Antibody-coated beads captures the single target biomolecules, which are then detected by another antibody conjugated with a labeled antibody. Loading of beads into femtoliter well arrays for isolation and detection of single molecules. (b) Fluorescence image of a small section of the femtoliter well array after signals from single molecules are generated.While the majority of femtoliter chambers contain a bead from the assay, only a fraction of those beads possesses catalytic enzyme activity, indicative of a single, bound protein. (c) The concentration of protein in the bulk solution is correlated to the percentage of beads that have bound a protein molecule

數字式單分子檢測方法提高了研究人員對酶機制和酶群體的異質性理解，將單酶分子捕獲到具有熒光底物的微孔中，在高通量的微孔陣列中同時觀測大量酶分子的活性，能夠獲得酶群長期的動力學狀態。數字式單分子檢測方法也可以直接以外周血為檢測對象，通過提取其生物標志物定量分析自身循環系統血漿中的細胞因子含量，與痊愈患者進行比較，觀察產生的生理變化，用于評估免疫療法的效果[38]。

2.2.1 核酸檢測

目前大多數的核酸檢測需要對目標DNA 或RNA 進行擴增，通常使用聚合酶鏈式反應(PCR)。在定量PCR (qPCR)中，每個擴增周期后通過熒光增強程度判斷擴增產物的相對豐度。這種方法可以在短時間內將目標序列擴增100 萬次以上，所需樣本量小[39]。除此之外，包括滾動環擴增反應(RCA)、雜交化鏈式反應(HCR)和環介導等溫擴增(LAMP)等技術也可用于核酸檢測，但是這些方法往往耗時費力、需要消耗大量樣本、并且靈敏度不足。

為了解決這些問題并獲得更高的靈敏度，數字PCR 方法對樣品進行稀釋，并將其劃分到含有一個或零個目標模板分子的孔中，從而允許對目標序列進行排除擴增偏差的絕對定量[40]，由此發展出的液滴數字PCR (ddPCR)方法利用油包水乳化液滴限制單個核酸靶點，能夠實現大規模數字化檢測。此外，數字式ELISA 的檢測方法能夠在不需要進行DNA 擴增的條件下，檢測亞飛摩濃度的基因組DNA[41]。該方法成功檢測到全血中濃度為0.016 fmol/L 的金黃色葡萄球菌的基因組DNA。數字式ELISA 方法對miRNA的檢測也具有極高的靈敏度，通過與目標miRNA序列互補的鎖定核酸探針的直接雜交，檢測限可達到1～10 fmol/L，能夠通過多重檢測飛摩濃度的具有單核苷酸錯配的同源miRNA[42]。除了高靈敏度之外，該方法還解決了逆轉錄定量PCR（miRNA 檢測的金標準方法）所面臨的樣品丟失和擴增變異的問題（如圖6所示，彩圖見期刊電子版）[43]。

圖6 數字式單分子陣列檢測技術進行MicroRNA 檢測[43]。（a）單個miRNA 分子通過與生物素化的探測器探針雜交到探針化的順磁珠中被捕獲。隨后加入鏈霉親和素結合酶來標記捕獲的miRNA 復合物，以便在與熒光酶底物孵育時產生熒光信號。（b）單個微珠與熒光襯底一起裝入飛升微孔陣列，隨后用油密封。然后將孔上熒光的數量作為目標miRNA濃度的數字讀數Fig. 6 MicroRNA detection with digital single molecule detection technology[43]. (a) Individual miRNA molecules are captured by hybridization to probecoated paramagnetic beads, along with biotinylated detector probe. The streptavidin-conjugated enzyme is subsequently added to label the captured miRNA complex, to allow generation of a fluorescent signal upon incubation with a fluorogenic enzyme substrate. (b) Individual beads are loaded along with fluorogenic substrate into a femtoliter microwell array, which is subsequently sealed with oil. The number of fluorescent “on” wells is then counted as a digital readout of the target miRNA concentration

2.2.2 蛋白質檢測

數字式單分子檢測技術最大應用領域之一是對神經病學和神經退行性疾病的診斷。常見的檢測對象包括神經絲光(NfL)、Tau 蛋白、淀粉樣蛋白(Aβ)、α-突觸蛋白 (a-synuclein)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)。這些蛋白在血漿中的濃度低于在腦脊液（CSF）中的濃度，血漿檢測比腦脊液檢測對人體的傷害小很多，因此需要一種靈敏度極高的技術，獲得對血漿中低濃度蛋白質的技術量化檢測指標，如數字式ELISA 單分子檢測技術。Mattsson 團隊證實患老年癡呆癥患者神經絲光NfL 血漿水平（平均51.0 ng/L）顯著高于認知健康的對照組的檢測物水平（平均34.7 ng/L），而輕度認知障礙患者（平均42.8 ng/L）與其他兩組之間無顯著差異[44]。其他研究人員也通過對血漿中NfL量化，確認額顳葉癡呆癥與其相關，且血漿中的NfL 濃度與腦脊液中濃度呈正相關。Gill 課題組使用單分子陣列技術對疑似輕度創傷性腦損傷(mTBI)患者與健康對照組的tau、NfL 和GFAP進行測量，結果表明患者血漿中檢測蛋白含量明顯偏高[45-46]。魯汶大學生物傳感器研究人員使用同一檢測方法對阿摩到皮摩的Tau 蛋白水平進行量化，證明了所提出的檢測方法與不同生物樣品中Tau 濃度范圍具有兼容性，獲得55±29 aM 的檢測限，靈敏度較商用產品提高了5 000 倍[47]。在另一項研究中，Dinh 等研究人員使用數字式ELISA 方法測量血清與尿液中肉毒桿菌神經毒素A1(BoNT/A1)量化值，檢測限分別達到200 pg/L和1 ng/L[48]。

除神經學標志物外，單分子陣列技術也越來越多地應用于檢測血液中的腫瘤標志物、心臟驗證標志物、自身免疫性疾病中的細胞因子與趨化因子等。

2.2.3 小分子的單分子檢測

為了檢測單個小分子，Wang 課題組將單分子陣列檢測調整為一種競爭性免疫分析形式，分析修飾的微珠或分析標記的酶與樣品中的目標分析物競爭結合，競爭免疫分析法成功用于檢測唾液和血清中的皮質醇和前列腺素E2。結果表明競爭免疫分析法對小分子的靈敏度較傳統競爭ELISA 法高出約50 倍[49]。

通過將單個分子限制在飛升級微反應器陣列中，基于微孔的檢測技術為檢測單個目標分子提供了一種強大的工具，提高了靈敏度。隨著靈敏度、小型化和成本效益的不斷提高，這種單分子生物檢測技術在推進臨床診斷和理解疾病機制方面表現出重要的潛力。

2.3 回音壁模式光學諧振腔（WGM）單分子生物檢測

回音壁模式光學諧振腔（WGM）作為無標的微納米傳感器，可以讓人們直接在光下觀察單分子水平的動態過程，具有高時間和空間分辨率，并且能夠響應影響光模式分布的環境擾動。WGM器件具有高靈敏度，此外，其結構具有多樣性且易于與現有制造設備(如傳統的基于芯片的技術)集成，促使WGM 傳感器廣泛用于生物分子檢測。典型的WGM 傳感器由一個低噪聲泵浦光源和一個高Q 值微腔組成。通過光的全反射將光波限制在諧振腔內，循環的光波會產生自干涉光學共振，光波倏逝場從微腔激發延伸到周圍的介質中，當生物分子與納米級光場重疊時，就會產生檢測信號（WGM 共振漂移）。理論上，生物分子與光相互作用，光波每循環一圈，路徑長度都會發生一些變化，這種路徑長度的變化使光的共振波長或頻率發生偏移[50]。利用諧振腔表面散射損失和吸收損失導致光學共振頻率信號變化，可實現生物分子的高靈敏檢測（如圖7 所示，彩圖見期刊電子版）[51]。為了將WGM 的檢測能力提升到單分子級別，可以通過增強光與金屬納米結構上分子的相互作用而實現，使用金屬納米結構將光集中在超出衍射極限的深亞波長尺度，以增強與單一分子的相互作用。然而，用這種方法獲得的單分子高分辨率，導致傳感部分縮小，有效傳感面積為納米粒子的結合部分的表面積，在與NPs 結合時，只有少量分子可以被識別[52]。另一種基于光學WGM 與微腔的機械本征模耦合的傳感方法，不受這種傳感體積減小的影響，其用足夠的功率激發空腔內的光波導，其共振頻率相對于諧振頻率略有藍移，則可以在亞Hz 線寬的頻率Vm上引起諧振腔的相干光機械振蕩(OMO)，振蕩頻率和它的高次諧波可以直接由腔發射的功率譜確定。由于腔內光場本身就像光彈簧一樣做機械運動，OMO 的頻率取決于激發頻率相對于WGM共振位置的失諧[53]。為了檢測特定的生物分子，需要使用分析特異性捕獲劑（抗體[54]、抗體片段[55]、互補核酸適體[56]、其他識別分子）對WGM進行修飾，在捕獲劑將待測分子捕獲到傳感區域中時，會導致共振波長偏移，由于這一現象，WGM 已被用于核酸、病毒、蛋白質、端粒酶活性等目標的檢測。研究人員基于該原理成功檢測到大腸桿菌聚合酶打開和關閉時信號的變化。通過改變檢測波長，也可以在蛋白質不同體積的位置探測單蛋白質動力學，這種多模態WGM 傳感器甚至可以使蛋白質的三維動力學達到原子級分辨率，成為單分子動力學研究的重要工具。

圖7 由諧振腔表面的全內反射激發的WGM[51]Fig. 7 Illustration of a WGM cavity excited by frustrated total internal reflection at a prism surface[51]

2.3.1 單分子檢測應用

WGM 的檢測方法為無標檢測，其對分子的類型往往無法識別，通常使用與待測分子尺寸匹配的微粒子代替。病毒一直對人類構成潛在威脅，早在2008 年，Vollmer F 課題組首次報道了使用模式偏移技術檢測單個甲型流感病毒粒子(半徑約50 nm)，從微球形WGM 的共振頻率/波長的離散變化觀察到單個病毒粒子的結合，通過減小微球的尺寸，可以增強離散波移信號的幅度。在使用與病毒大小相當的聚苯乙烯納米顆粒的實驗中，證實傳感機制與模式體積成反比。將此效應的基礎電磁理論與實驗進行比較，既可以從最佳共振位移直接獲得結合病毒粒子的大小和質量[57]。美國伊利諾伊大學研究團隊應用無標的硅光子微環諧振器直接在一個復雜的分析矩陣檢測完整病毒的純化樣品，并且對菜豆莢斑駁病毒(一種重要的農業病原體)實現了定量檢測，檢測限為10 ng/mL。通過在緩沖液中研磨少量葉片樣本，于45 min 內，就可以識別受感染的葉片[58]。空氣中也存在很多微小的病毒分子，Shao L 團隊研究人員基于自由空間耦合的微環面成功檢測出了單個聚苯乙烯顆粒(半徑為70 nm)以及空氣中的病毒粒子[59]。蛋白質的尺寸通常小于病毒的尺寸，在對蛋白質分子進行檢測時，就需要更高的靈敏度WGM 檢測裝置，才能實現對蛋白質的定量檢測。許多研究小組已經實現了在純緩沖溶液和復雜介質中對蛋白質的直接檢測[60-61]。Robison H M 課題組利用循環免疫細胞中結核相關抗原和對照抗原暴露進行多重細胞因子免疫分析，驗證了適用于結核桿菌(LTBI)的7-plex 細胞因子檢測。該方法具有良好的動態范圍、檢測限和重現性，與單酶聯免疫吸附測定法具有良好的相關性，準確地檢測和量化了患者的PBMCs 在結核相關抗原和對照抗原刺激后分泌的7 種細胞因子濃度，并與強大的特征選擇方法相結合，揭示了與LTBI 狀態和再激活風險相關的個體規范化免疫信號[62]。近期，肖云峰教授和龔旗煌院士課題組首先成功制備出壁厚約為1 μm 的微泡腔，并利用熱光效應進行篩選，進一步將微泡腔接入微流系統構成微流光學傳感器，并成功實現了單鏈DNA 分子的檢測[63]。

2.3.2 蛋白質分子構象動力學檢測

蛋白質結構內的動態運動是極其復雜的，涉及到與結構運動和波動相關的不同時間尺度、運動幅度和不同方向。大多數蛋白質的功能來自于復雜的三維結構和結構的改變，通常在與其他分子的相互作用，或環境條件如溫度和PH 值的變化時發出響應，蛋白質可以在很短的時間間隔內采用許多不同的構象，因此檢測蛋白質的構象動態對于更好地理解其生物學功能至關重要。為了觀察蛋白質的結構動力學，常常需要對單個分子進行研究。研究單個蛋白構象變化的一種方法是將光集中在深亞波長尺度上，以增強與單一蛋白質的相互作用。通過附加一個等離子體金屬納米棒，可以將光集中到一個蛋白質的尺寸(約10 nm)，生物分子與這種光場相互作用可產生檢測信號[64]。通過這種方法，已經有科研人員實現對固定在WGM 傳感器上的活性聚合酶的構象運動的檢測。利用這種無標的光學檢測方法觀測出單分子水平上的相互作用和相關的構象變化[65]。為了實現具有多個傳感通道的WGM 傳感器平臺，研究人員利用不同的激光探測蛋白質分子動力學，從而獲得蛋白質不同部分的動力學信息。通過使用等離子體金納米顆粒耦合WGMs，以微秒時間分辨率探測周轉期間的酶構象動力學，對單分子水平上酶周轉的溫度依賴進行研究，并對其建立物理模型，成為研究酶周轉和熱力學之間關系的重要工具[66]。

2.4 表面增強拉曼光譜（SERS）單分子生物檢測

拉曼光譜是一種功能強大的分析工具，可以探測分子的震動指紋信號，根據拉曼光譜固有的特異性，可以對物理、化學和生物的復合系統進行分析。這種光學技術具有低損害性和用途廣泛等特點，可用于固體、液體和氣體樣品的研究，已被應用于化學檢測、疾病診斷和環境監測等領域。然而，自發拉曼散射很弱，拉曼光譜的靈敏度較低。表面增強拉曼光譜(SERS)能夠顯著增強表面吸附分子的拉曼信號，克服傳統拉曼光譜靈敏度低的限制。經過技術的不斷完善，SERS 技術在生物傳感領域表現出優異的靈敏度。通常利用互補核酸、抗體和適配體作為識別病毒的識別元件[67]。在SERS 發展的早期階段，使用表面粗糙的金屬襯底，能夠為被檢測分子提供良好的拉曼增強[68-69]。但是，由于粗糙的金屬基底對場的增強能力有限，不足以滿足單分子檢測。隨后，研究證明大幅的電磁增強，可以使測量非共振分子拉曼微分截面的SERS 信號在10-29～ 10-30cm2/sr范圍內[70]。SERS 襯底(如非晶態Au 襯底)表面原子遷移會使測量到的單分子信號受到影響[71]。在SERS 理論中，電磁場方法激活的拉曼增強因子與局域電場增強的四次方成正比，表示為：

其中E0(r0,ω)是 入射光的電場，E(r0,ω)為熱點處的局部電場。相應的增強拉曼強度可表示為：

其中A表示實際中與用于采集拉曼信號的光學系統的采集效率相關的系數；| α(ωR,ω)|表示被檢測分子的拉曼極化率；I0(r0,∞)表示入射光強度[72]。根據公式（2）可知，使用特定的光學系統來提高SERS 測量的靈敏度，主要有兩種增強方法。一個是局域電場增強，對應于EM，另一個是增加被檢測分子的拉曼極化率，對應于CM。

SERS 單分子生物檢測可以在不統計平均值的情況下觀察單分子中細微的光譜現象。實驗驗證，SERS 單分子檢測可以準確觀察到拉曼峰的均勻展寬和非均勻展寬。在應用方面，SERS 單分子生物檢測顯著增加了拉曼光譜的可應用區域[73]。利用單分子SERS 技術，在單分子水平上實現了對還原氧化反應和催化反應的實時監測，可用于指導具有最高催化活性的多相生物催化劑的設計[74]。

2.4.1 病毒檢測

病毒感染是導致人類發病和死亡的主要原因之一，給衛生保健系統造成了重大經濟成本。SERS 技術是一種非常可靠的常規病毒感染快速識別技術。譜分析統計方法的發展使得人們能夠對同一病毒不同毒株的SERS 光譜加以區分。例如，銀納米棒陣列用于SERS 技術可檢測幾種致病性病毒，如腺病毒、鼻病毒和人類免疫缺陷病毒等[75]。此外，還可以區分不同毒株的甲型流感病毒[76]、呼吸道合胞病毒[61]和輪狀病毒[77]。Oganes Ambartsumyan 課題組于2021 年，以多層金底物制備新型SERS，成功識別出濃度為106pfu/ml的腺病毒和柯薩奇病毒(其中pfu 是斑塊形成單位，即感染病毒顆粒的數量)[61]。相關研究團隊還使用SERS 檢測方法磁捕獲病毒基因組，使用鍍金的順磁納米粒子(NPs)，其既可用作SERS 底物，也可作為從其他成分靶向純化病毒基因組的高效方法[78]。而Saira Nasir 課題組通過SERS 方法，采用多元數據分析技術，實現對血液樣本中丙型肝炎病毒(HCV)的定性與定量分析，準確率達99%[75]。采用夾心法對流感病毒進行全病毒捕獲和血凝素適配體鑒定。初級適配體附著在SERS底物的金屬顆粒上，捕獲流感病毒并與具有拉曼活性分子標記的二級適配體結合。捕獲流感病毒顆粒后，加入拉曼染料標記的二級適配體（如圖8 所示，彩圖見期刊電子版），使用拉曼染料在生物液中幾分鐘完成檢測，并成功檢測到多種A 型流感病毒株[79]。

圖8 核酸適體的病毒顆粒在固體基質上的檢測[79]Fig. 8 Detection of virus particles of aptamer on solid substrates[79]

2.4.2 蛋白質檢測

SERS 可以檢測蛋白質的內在信號，因此可以作為一種有效的蛋白質檢測方法。PENG Y S課題組于2021 年利用Nb2C 和Ta2C MXenes 在電荷轉移共振增強和電磁增強的協同作用下，顯著增強SERS，準確識別5×10-9M 的SARS-CoV-2刺突蛋白，有利于實現新型冠狀病毒的實時監測和預警[80]。隨后，2022 年DELPHINE 課題組也對世界范圍內快速傳播的新冠病毒進行SERS 檢測，通過對人體的SARS-CoV-2 刺突蛋白單鏈抗體文庫進行生物篩選，獲得了結合SARS-CoV-2刺突蛋白的單鏈抗體片段。將單鏈抗體與磁性納米顆粒和SERS 納米標記相結合，形成免疫復合物，在病毒載體中檢測SARS-CoV-2 刺突蛋白，30 min 內檢測限為257 fg/mL。同時檢測到B.1.1.7 (alpha)、B.1.351 (beta)和B.1.617.2 (delta)刺突蛋白，與冠狀病毒HKU1 刺突蛋白無交叉反應[81]。LIU B 課題組基于金銀核殼結構的SERS 納米標記和多氯聯苯(PCBS)相結合的生物傳感器，實現具有寬線性動態范圍的蛋白質超靈敏檢測。結果表明，該生物傳感器對小鼠免疫球蛋白G（IgG）具有良好的檢測限672 fg/mL，線性動態檢測范圍為10 pg/mL～10 μg/mL[82]。然而，由于SERS 信號的復雜性和不可靠性，需要對目標蛋白進行純化。科研人員在SERS 的基礎上研發直接免疫分析(SERSIA)技術離心，將金納米顆粒(GNPs)均勻地包裹在目標蛋白上，與靶蛋白密切接觸，可以檢測到靶蛋白的內在信號，能夠在微米范圍內對固定化蛋白進行定量成像[83]。

2.4.3 生物標志物檢測

SERS 被認為是一種非常有前途的超靈敏技術，甚至可以檢測單個分子，長期以來一直被認為是一種強大的微量生物標志物分析工具。同步的癌癥生物標志物檢測為癌癥的早期診斷帶來了巨大希望。在相關檢測初期，SERS 單分子生物檢測可用于同時檢測多種肝癌相關的microRNA(miRNA)生物標志物，通過合成3 種高度均勻、可重復的納米標記，產生強烈的SERS 信號，其具有特征的拉曼光譜。上述結果表明SERS 納米標記具有很高的靈敏度和優良的復用檢測能力，在研究3 個目標miRNA 的同時，通過多重和定量測定，成功地進行了矩陣分析，檢測限在皮摩范圍內[84]。最近，國內研究團隊使用SERS的檢測方法對外泌體和上清血液中的microRNA，通過Fe3O4@Ag-SERS 輔助增強接受信號，單基的錯配識別達到1aM，在這個靈敏度下，可以將胰腺癌與慢性胰腺炎(CP)和正常對照(NC)區分開來[85]。隨著新型分析技術的發展，矩陣化生物檢測方法越來越受到人們的重視，采用光子晶體(PC)和SERS 作為兩種編碼元素，在不同模式下對多重生物檢測進行雙重編碼。在實踐中，PC 微珠和SERS 納米標記分別作為載體和標簽，以三明治形式對抗原進行多重檢測。雙編碼多重生物檢測具有極低的背景和干擾，以及高穩定性和重復性。定量分析結果表明，該檢測系統具有良好的分析性能和較高的靈敏度。對腫瘤標志物AFP 和CEA 的多重檢測結果表明，該方法具有靈敏度高、檢測范圍廣、交叉反應性低的特點[86]。LI 課題組利用SERS 有序金納米蜂窩陣列可同時靈敏檢測3 個或3 個以上目標。SERS 是一種有效的分子成像光學形態，由于其固有的性質，生成的增強拉曼光譜分析物接近納米粗糙銀等貴金屬表面(Ag)或金(Au)。由于化學物質獨特的窄指紋拉曼光譜，SERS 技術為生物醫學研究提供了多參數分子分析和多路復用等具有重要意義的方法。這些特征增強的拉曼光譜從一個特定的分子物種可以明確用來識別和量化混合物中的不同目標[87]。

2.5 CRISPR（聚簇規則間隔短回文重復）單分子檢測

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic repeats)序列是一種基于基因組編輯的技術，目前已被廣泛應用于生物學研究中[88]。CRISPR 不僅可以用于核酸生物標志物的檢測，以其為基礎的特異性高靈敏度酶促報告子解鎖(SHERLOCK)和DNA內切酶靶向CRISPR 反式報告系統(DETECTR)對檢測病毒與細菌核酸也表現出單分子層次的超高靈敏度（如圖9 所示，彩圖見期刊電子版）[89]。這些方法靈敏度可以用于檢測特定的阿摩爾單鏈DNA 或RNA 序列和高特異性的單堿基錯配。

圖9 兩種檢測病毒RNA 的CRISPR 方法[89]。（a）SHERLOCK 方法；（b）DETECTR 方法Fig. 9 Two CRISPR methods for detecting viral RNA[89]. (a) SHERLOCK assay; (b) DETECTR assay

基于CRISPR 的方法也適用于矩陣檢測。例如，使用具有特定切割偏好的不同Cas 酶進行多重SHERLOCK 測定，實現了4 個RNA 和DNA 靶點的多重檢測，保持了在阿摩級范圍內的靈敏度[90]。SHERLOCK 和DETECTR 的 主 要 優 點 是它們適用于即時診斷。SHERLOCK 已經在基于紙張的橫向流動分析中實現超靈敏的核酸檢測，可以快速檢測核酸（小于90 min），且檢測儀器便于制造。SHERLOCK 更被用于檢測血清、唾液和尿液樣本矩陣中的登革熱和寨卡病毒[91]。SHERLOCK 還因其具有檢測單堿基差異的能力，可用來區分密切相關的病毒株[92]。該技術還被用于檢測引起宮頸癌的人乳頭瘤病毒，采用DETECTR 對兩種不同類型的人乳頭狀瘤病毒(HPV)進行檢測，響應時間為1 h。其他Cas 酶與DETECTR 配合檢測可以提高檢測性能，例如Cas14檢測DNA 單核苷酸多態性（基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態性；SNPs）用于檢測游離細胞的DNA，可用于癌癥的診斷[93]。

3 單分子檢測方法總結

在這篇綜述中，介紹了一些前沿的單分子檢測方法及相關應用，并對文中綜述的檢測方法的特點進行匯總（表1）。

表1 文中不同單分子生物檢測方法的優缺點對比Tab.1 Advantages and disadvantages of various methods of single molecule biological detection

4 未來展望及總結

不同方法的靈敏度、特異性、動態范圍、矩陣檢測和成本對于單分子檢測技術都十分重要。單分子生物檢測在生命科學領域具有革命性的突破，不僅在于對疾病的早期診斷與治療上，更突出體現在準確了解潛在生物學機制上。許多檢測方法不能提供足夠的敏感性和特異性，單分子生物檢測的目的是可以實現對生物分子的定量分析，定量是理解反應動力學和生物系統分子動力學的核心，也是核酸檢測、測量從病變細胞分泌到血液中的蛋白質、測量與神經系統疾病相關的生物標記物等的核心。在這些技術中，生物傳感器對單個分子表現出較高的靈敏度和選擇性。基于單分子檢測的方法都具有各自的優勢，雖然這些檢測方法或系統得到了優秀的實驗結果，大幅提高了原有的靈敏度與分辨率，但還存在很多需要突破的關鍵方向，比如，待測分子的實時量化、生物體內或細胞內的生物傳感、多路復用能力、不同生物分子檢測的通用性、檢測速率等仍存在局限性。這是未來能夠讓人們對生命科學有更深認識的關鍵，需要科研人員共同努力繼續優化，解決尚存的問題，以應用、實用為主，實現多種正交技術的分析。