中性粒細胞胞外誘捕網的形成與調控

歐陽慧敏 ， 李錦宏 ， 郭建波 ， 孫 遜 ， 李欣然，2 ， 曹嫦妤，2

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院 ， 廣東 佛山 528225 ；2.佛山科學技術學院附屬教學動物醫院 ， 廣東 佛山 528225)

中性粒細胞胞外誘捕網(Neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細胞參與免疫防疫的重要途徑。科學家最初認為NETs作為中性粒細胞的一種防御手段，有助于宿主的先天免疫，還可以捕殺金黃色葡萄球菌、白色念珠菌酵母相和菌絲相等多種病原體，起到免疫抗菌的作用，防御病原體入侵；隨著研究的深入，研究者發現NETs有“雙刃劍”的作用：當機體不能保證NETs產生和降解平衡時，NETs可能反過來作為自身抗原，引發機體免疫反應，參與自身免疫性疾病[1-2]、腫瘤[3]和炎性疾病[4-5]等的發生或發展過程，導致機體組織受損。NETs對馬、奶牛、豬以及伴侶動物疾病的預防和誘發過程都有影響。本文從NETs的形成和調控、疾病的預防和誘發進程等方面予以綜述，旨在為獸醫研究NETs的作用機制和藥物靶向應用提供一定的科學依據。

1 NETs的形成

2004年，Brinkmann等[6]發現，在白細胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)、肉豆蔻酸佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)以及脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激后，中性粒細胞中形成了特殊的網狀結構，通過高分辨率掃描電鏡觀察發現其是以DNA為骨架結構，并固定有各種蛋白顆粒的纖維網狀，命名為NETs，這種結構的形成過程稱為NETosis。NETosis是一種不同于壞死和凋亡的中性粒細胞新型死亡方式[7-8]。早期研究發現，NETs的構成包含髓過氧化酶(Myeloperoxidase，MPO)、組織蛋白酶G(Cathepsin G，CTSG)、中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)等顆粒蛋白[9]。隨著研究深入，科學家進一步發現了NETs組成中除顆粒蛋白外的其他蛋白成分。且采用不同的NETs收集程序或蛋白質鑒定技術檢測出的蛋白組分略有差異。這些組分與NETs在動物疾病中的生理作用密切相關。

中性粒細胞是機體先天免疫的重要參與者，研究發現NETs的形成(NETosis)是中性粒細胞清除病原的有效途徑。NETs的形成主要依賴于葡萄糖糖酵解，一定程度上依賴谷氨酰胺、腺膘呤核苷三磷酸(ATP)和酶[10]。當中性粒細胞受微生物、細菌產物、化學試劑等刺激活化后，可以通過2種途徑啟動NETosis，一種是經典型的NETosis，主要由NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)介導產生活性氧(ROS)，引起氧化應激，線粒體能量產生和代謝障礙，細胞核空泡化，最終細胞內染色質解聚，質膜解體[11]。另一種類型的NETosis是NOX非依賴型，是由電壓依賴性鈣激活的鉀通道3(SK3)的開放支持[12]，其發生與生長因子、細胞因子和熱休克蛋白等細胞外刺激關系密切(封二圖1)[11]。

圖1 NRTSD的形成[11],[13]

2 NETs形成的調控

NETs的發生與動物疾病病理過程相關，而不同誘導方式最終產生的NETs有差異，這可能是由于NETosis涉及多種不同的信號轉導機制所導致[14]。這些生物學信號轉導途徑可能對NETs的生物學效應有不同影響，是目前研究調控NETs對相關疾病影響和新治療策略的著力點。

組蛋白瓜氨酸化(Citrullinated histone H3，H3Cit)被認為是體內和體外誘導后NETosis形成的關鍵早期步驟，評估早期H3Cit水平可作為預測后期NETosis的指標，是NETs形成的生物標志物之一[15]。Gavillet等[16]通過對條件基因敲除小鼠使用離子霉素和PMA誘導后檢測純化多形核中性粒細胞NETosis及H3Cit水平變化的研究，發現Vav/Rac/Pak信號級聯影響NETs的形成；Ras相關的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)和Ras相關的C3肉毒素底物2(Rac2)基因缺失后小鼠多形核中性粒細胞基礎H3Cit水平顯著降低，經離子霉素和PMA誘導的NETosis顯著減少；Rac的激活劑Vav1和Vav3的聯合缺失也可以在一定程度上減少NETosis；Pak是Rac的效應器，主要通過其N端調節黏附區的p21結合域與上游調節器Rac相互作用從而使Rac/Pak信號轉導激活；使用Pak抑制劑IPA-3和PF-3758309處理，均可以減少NETosis，并且IPA-3在5 μmmol/L水平抑制Pak時，可幾乎完全消除離子霉素和PMA誘導的NETosis。表明Rac和Pak信號轉導是調節NETs形成的一個有效通路。

P-選擇素的信號也可以介導NETs的形成。用凝血酶激活的血小板與中性粒細胞也可共同誘導NETosis。而血小板-中性粒細胞的相互作用主要是由P-選擇素介導的細胞間的相互影響。P-選擇素是一種糖蛋白，存在于血管內皮細胞的棒桿狀Weibel-Palade小體的小體膜及血小板α顆粒膜上。其配體是唾液酸化路易斯，高親和力的配體是P-選擇素糖蛋白配體1，主要表達于中性粒細胞和單核細胞。Etulain等[17]通過小鼠體外誘導試驗發現P-選擇素激活中性粒細胞整合素，活化血小板參與NETosis。P-選擇素相關的信號建立對血小板誘導NETs的形成有調控作用。

不同誘導因素對NETosis影響不同，造成NETs生成量不同，NETs形成能力或水平高低與許多生理病理過程有關。可利用脫氧核糖核酸酶I(Deoxyribonuclease I，DNase I)加強NETs的降解，或直接將NETs和疾病相互作用的信號轉導途徑、介導因子作為靶標對NETs生成進行調控。

3 NETs參與機體免疫過程

當機體內NETs生成和降解達到平衡，其對動物疾病起有效的先天性免疫作用。NETs的纖維結構可以向炎癥部位局部輸送高濃度的抗菌因子，進而將結合的微生物隔離，殺滅病原體。NETs也可作為一種物理屏障，預防病原體進一步侵入[6]。研究發現，中性粒細胞可感應微生物大小并選擇性釋放NETs以抵抗大型病原體。這種選擇依賴于吞噬和NETosis兩個過程對中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)的競爭。當中性粒細胞遇到較大且無法被吞噬的微生物時，由于沒有吞噬體，NE可以通過一種不涉及膜融合的替代途徑緩慢釋放到胞漿中。然后NE自由地轉移到細胞核，并驅動染色質去致密化。這種簡單而有效的機制允許吞噬細胞區分小病原體和大病原體[18]。中性粒細胞具有多樣的抗菌方式，在抵御疾病時，可以選擇實施有效的抗菌策略以清除病原體，NETs作為其中的一種途徑，對維護機體健康有積極的影響。

NETs對真菌感染有抵御作用。研究發現在白色念珠菌感染后，中性粒細胞釋放的NETs含有鈣衛蛋白。動物試驗已證明鈣衛蛋白對小鼠局限性膿腫、肺念珠菌病和系統性白色念珠菌病的白色念珠菌生長都有抑制作用。白色念珠菌定殖的區域顯示有網狀結構覆蓋真菌表面[19]。當白色念珠菌侵入機體時，與含鈣衛蛋白的NETs相互作用，有助于抑制真菌感染。

NETs可以抵御細菌感染。Li等[20]研究報道,肽酰基精氨酸脫亞氨酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)可以催化組蛋白瓜氨酸化，從而誘導染色質去致密化，形成NETs。并通過菌落形成分析和小鼠試驗表明，經PAD4介導形成的NETs對痢疾桿菌和化膿性鏈球菌均有殺菌作用。PMA刺激中性粒細胞生成NETs，通過過氧化物酶活性測定出形成的NETs中含有MPO，對感染的金黃色葡萄球菌有殺滅作用[21]。NETs在豬鏈球菌清除和炎癥中也有重要作用，有助于防止豬鏈球菌感染。豬鏈球菌2型被認為是主要的豬病原體之一，對豬或與豬肉產品接觸密切的人群存在健康威脅[22]。中性粒細胞是防御豬鏈球菌2型感染的第一道免疫防線，NETs可發揮其介導的殺傷作用抵抗豬鏈球菌2型侵入機體。Zhao等[23]采用了3種豬鏈球菌2型強菌株感染純化的中性粒細胞，進行胞外核酸染料染色后，通過激光掃描顯微鏡觀察到所有菌株都可以在早期誘導NETs的生成。

此外，王超群等[7]通過健康母豬外周血分離的多形核中性粒細胞進行試驗，證明NETs的形成與孕酮誘導劑量以及孵育時間呈正相關。也有報道指出引起犬子宮蓄膿的細菌可以誘發NETs，但是NETs在該疾病中的利弊還未確定[24]。不可否認，NETs在先天性免疫過程中對抵御動物疾病有幫助。

4 NETs參與疾病過程損害機體

雖然對NETs參與疾病過程的細胞機制還有待研究，但是越來越多證據表明NETs除了捕捉和殺死病原體外，與許多疾病有相關性。

4.1 NETs誘發組織和細胞損傷 C型凝集素受體成員Dectin-1是主要的抗真菌吞噬受體之一，通過外周血中性粒細胞體外和體內試驗發現，利用Dectin-1的吞噬作用作為微生物體積大小的傳感器，可通過減少中性粒細胞蛋白向細胞核的移動來阻止NETs的釋放。Dectin-1缺陷導致吞噬功能受到干擾后，中性粒細胞可能不加選擇的釋放NETs，導致組織損傷和宿主死亡[18]。

NETs組成成分具有的細胞毒分子和蛋白酶可能造成組織損傷。魏正凱[25]研究證實奶牛乳腺導管中，NETs的組蛋白成分可以通過激活Caspase-1、NLRP3和Caspase-3途徑，誘導乳腺上皮細胞焦亡、凋亡和壞死，損傷乳腺組織(封二圖2)。LPS誘導的急性肺損傷小鼠模型中，肺組織和支氣管肺泡灌洗液中都檢測到NETs存在。在通過NETs對上皮細胞和內皮細胞的直接作用研究中發現，NETs可誘導上皮細胞和內皮細胞的毒性作用。而將內皮細胞、肺上皮細胞與未消化或DNA消化的NETs共同孵育時發現，NETs所含的DNA成分不改變NETs介導的細胞毒性作用。Saffarzadeh等對NETs蛋白成分的研究表明，NETs的細胞毒性在很大程度上是由組蛋白介導的，MPO也在一定程度上介導NETs的細胞毒性。NETs介導細胞毒性這一特點表明其可能參與造成肺損傷[26]。

圖2 NRTs對牛奶乳腺組織損傷作用[25]

肥胖與代謝綜合征在伴侶動物中并不少見，其相關的血管異常表現之一是內皮功能障礙，而NETs積累可以對內皮功能造成影響。Gupta等[27]報道在體外條件下，毒胡蘿卜內酯或腫瘤壞死因子α誘導的中性粒細胞和活化內皮細胞共同培養物中檢測到NETs形成，長時間與NETs接觸的內皮細胞死亡，此過程可能由內皮細胞激活產生的IL-8介導。這種損傷可以通過加入二苯碘酸抑制NETosis所需的NAPDHA氧化酶途徑或DNase破壞NETs而消除。Wang等[28]采用喂食小鼠高脂肪食物，建立飲食性肥胖小鼠模型，發現與正常小鼠相比，模型小鼠中NETs形成標志物Cathelicidin相關抗菌肽顯著增加；試驗還顯示，用DNase降解NETs或氯酰胺預防NETs形成可以恢復飲食性肥胖小鼠腸系膜動脈內皮依賴性血管舒張功能。這些發現都提示NETs在內皮功能障礙中起重要作用，并且這種作用對機體是不利的。

4.2 NETs促進凝血性疾病發生發展 NETs是獲得性凝血病的關鍵激活因子。NETs的有效誘導因子之一是血小板，已有研究證明血小板-中性粒細胞促進NETosis的潛在機制[29]。當血小板、凝血因子和纖維網狀結構上組蛋白和彈性蛋白酶接觸后，血小板活化、聚集，纖維蛋白沉積引起血栓形成，從而阻塞微血管，導致灌注減少和器官損傷[30]。當血小板參與NETosis時，血小板和NETs之間相互作用對動物的炎癥性疾病和血栓形成有促進作用，對機體健康造成損傷。

NETs與血栓形成有相關性。趙晶斌等[31]通過中外數據庫檢索了自2004年以來與NETs和靜脈血栓栓塞癥相關的研究報道，通過篩選和總結表明NETs參與了血栓形成的起始和生長階段：內皮細胞的活化和Weibel-Palade小體的釋放對血栓形成起始階段起重要作用，而NETs誘導內皮損傷，促進血栓形成；同時，NETs可以作為血小板黏附聚集的支架；并且NETs組分中彈性蛋白可以使組織因子途徑抑制劑水解而失活，促進外源性凝血過程。而組成成分中組蛋白、DNA與凝血因子之間的相互作用，使NETs參與內源性途徑的凝血過程[31]。Brill等[32]在狒狒試驗性下肢深靜脈血栓中，檢測到細胞外DNA在血漿中積累，在靜脈血栓中存在DNA及組蛋白。進一步通過下腔靜脈血流限制建立實驗性深靜脈血栓小鼠模型，通過免疫組化檢測到血栓中存在NETs的成分，表明NETs促進了深靜脈血栓的形成[32]。

4.3 NETs加重自身免疫性疾病 NETs參與自身免疫疾病過程。動脈粥樣硬化發病的主要驅動力是巨噬細胞分泌的細胞因子白細胞介素1β(Interleukin-1beta，IL-1β)。Warnatsch等[1]應用小鼠動脈粥樣硬化模型發現，膽固醇晶體既是IL-1β產生的啟動信號，又是激活炎癥小體加工IL-1β的危險信號。膽固醇晶體能觸發中性粒細胞釋放NETs，NETs啟動巨噬細胞釋放細胞因子，激活動脈粥樣硬化斑塊中擴增免疫細胞募集的輔助性T淋巴細胞17(Th17)。因此，危險信號如膽固醇晶體可通過與中性粒細胞的相互作用而產生NETs，驅動無菌性炎癥。此外，未被降解的NETs激活補體可加重系統性紅斑狼瘡病情。研究發現，系統性紅斑狼瘡患者血清對NETs的降解能力降低，無法恢復NETs降解能力的病患病情相對更加嚴重，血液中補體蛋白C4和C3水平也較低。補體部分具有結合DNA潛力的蛋白與NETs相互作用，其中C1q結合良好，C3b沉積在NETs上。進一步研究發現，C1q抑制血清和純化C1q與DNase-I組成的系統中NETs的降解，并且C1q在生理濃度下不抑制血清中NETs的降解。研究表明，NETs可以激活補體，進而誘導炎癥和調節適應性免疫反應，從而產生NETs特異性抗體。NETs降解減少導致補體沉積和自身抗體沉積，招募更多補體，形成NETs降解減少和促炎反應的惡性循環[2]。

5 展望

NETs作為非特異性免疫的組成部分之一，是動物機體中不可或缺的一種抵抗病原入侵的途徑。但是在某些情況下，NETs又參與疾病的發生發展，造成可能的組織損傷甚至危及動物生命。然而，NETs在動物疾病發生發展中的機制還有很廣闊的研究空間和應用前景，NETs的有益作用以及有害作用之間的具體界限有待量化。鑒于NETs獨特的雙面性，怎樣調控和量化NETs的形成，發揮其殺滅病原的積極作用，盡量預防其抑制機制失調或被過度激活帶來的負面作用，對于疾病的防控具有重要的臨床意義。

綜上所述，通過調控NETs的形成和抑制可以為動物疾病的治療提供新的靶向，但NETs相關疾病研究目前仍處于起步階段，如何建立NETs靶向以達到防治疾病的目標還需要深入研究。本課題組前期研究已發現，NETs可調控mTOR通路、PI3K-ERK通路和腸細胞緊密連接通路等，參與由于硒缺乏、鋁中毒以及鎘暴露引起的組織和細胞損傷。但是，如何把這些分子機制應用到臨床疾病的預防和治療，還需要更深入的研究。