基于生物信息學分析和網絡藥理學探討黃連解毒湯干預動脈粥樣硬化斑塊破裂的作用機制①

李曉輝 彭廣操 李興淵 王建茹（河南中醫藥大學第一附屬醫院，鄭州 450000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為一種慢性進行性血管疾病，其發生發展涉及內皮功能障礙、炎癥損傷、脂質浸潤和纖維帽破裂等多種病理因素。歷經幾十年的緩慢發展，動脈斑塊可能會突然繼發血栓，或斑塊出血，常表現為急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）。而導致ACS的罪魁禍首是不穩定斑塊破裂。2004年共識聲明中首先提出了導致ACS的血栓斑塊為“斑塊破裂”，并指出其是一種具有嚴重損傷的斑塊，在纖維帽中具有真正的缺陷或間隙，將富含脂質的動脈粥樣化核心與流動的血液分離，從而暴露出斑塊的血栓形成核心［1］。研究發現，全球1 847例致命性動脈血栓中有73%存在斑塊破裂［2］。目前導致斑塊破裂的機制尚不明確，以斑塊破裂為導向的治療效果欠佳，所以識別不穩定斑塊破裂的靶基因及機制，對于防治斑塊破裂、形成血栓，預防急性心血管事件的發生具有重要意義。

中藥復方具有多成分、多靶點、多途徑和多效應的特點，在治療復雜性疾病方面表現出療效確切、毒副作用小的優勢，但其作用機制研究是一直以來的重點和難點。黃連解毒湯（Huanglian Jiedu Decoction，HLJDD）出自《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味藥物組成。本方苦寒直折，具有清熱解毒之功。研究證實，HLJDD聯合常規西藥能明顯改善急性心肌梗死介入術后患者心絞痛癥狀，顯著降低超敏肌鈣蛋白Ⅰ（hypersensitivity troponinⅠ，hs-TnⅠ）、N末端B型腦鈉鈦前體（N-terminal Bbrain natriuretic peptide，NT-proBNP）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）、血小板聚集功能測定、血清磷脂酶A2及冠脈校正TIMI幀數水平，抑制巨噬細胞極化，有效減少心肌損傷改善心肌功能，且安全性較好［3-4］；還可顯著改善ACS患者PCI術后內皮功能（VEGF、NO），降低炎癥反應，促進側支循環的建立［5］。提示HLJDD可延緩或抑制斑塊破裂，但其作用機制不明顯，限制了其在臨床的應用與發展。

近年來，利用生物信息學方法對芯片基因表達數據和高通量測序數據進行整合分析已經廣泛應用于各種疾病的研究。穩健排序整合（robust rank aggregation，RRA）方法可用于各種排序基因列表的比較，可有效避免在篩選差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的過程中因樣本數有限、技術平臺差異等因素對研究結果產生偏倚的情況［6-7］。網絡藥理學是基于目標分子、生物功能和生物活性化合物產生復雜的相互作用網絡，符合中藥復方的天然特征，不僅能夠從分子水平上系統地闡明中藥復方的作用機制；還可以對中藥復方做出整體性預判和前瞻性預測，以彌補分子生物學的局限性［8］。目前已有諸多學者成功地將其應用于闡釋中藥復方治療疾病的物質基礎和潛在作用機制的研究中。基于以上的認識，本研究利用網絡藥理學結合生物信息學分析的方法探索具有解毒功效的HLJDD延緩或抑制AS由穩定斑塊到破裂過程的作用機制，以期為后續的研究提供一定參考；同時，以方測證，以證驗因，在一定程度上可闡述AS中醫“毒損脈絡”“毒致易損斑塊”的科學內涵。

1 資料與方法

1.1 芯片數據的來源從GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和ArrayExpress數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）中下載含有人頸AS穩定和破裂斑塊組織相關的數據集，詳見表1。

1.2 數據預處理和DEGs的篩選 以E-MTAB-2055和GSE41571為基因芯片數據集，利用perl腳本對表達數據進行注釋，將探針矩陣轉化為基因矩陣；然后，利用avereps函數對基因對應多個探針取均值，利用normalizeBetweenArrays函數對數據進行矯正，若基因表達數值較大，則需取log2；最后，利用limma包篩選DEGs。GSE120521為轉錄組測序數據，利用avereps函數對重復基因名取均值后，利用wilcoxTest篩選DEGs。以|log（fold change，FC）|＞1和P＜0.05為閾值對3個數據集的表達數據進行差異分析。

表1 數據集的詳細信息Tab.1 Details of data set

1.3 RRA法整合分析芯片數據利用穩健排序整合RRA包對3個數據集中的DEGs進行整合，以|log2FC|＞1和P＜0.05為條件篩選穩健DEGs，然后利用pheatmap包繪制P值Top 20的上調和下調基因的熱圖。

1.4 HLJDD相關活性成分及作用靶點的篩選在TCMSP數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中，輸入HLJDD中4味中藥名稱，即黃連、黃柏、黃芩、梔子，搜索得到各藥化學成分，通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug likeness，DL）≥0.18對4味中藥所含的所有化合物進行篩選，獲取其活性成分；同時，在該數據庫中獲取相應活性成分的作用靶點。在PubChem數據庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取HLJDD的活性成分的Canonical SMILES結構；然后，在Swiss Target Prediction數據庫（http：//swisstargetprediction.ch/）中對HLJDD活性成分的作用靶點進行預測，并剔除Probability=0的靶點。整合所有活性成分的作用靶點，即為HLJDD的作用靶點。

1.5 HLJDD-AS交集DEGs的獲取及HLJDD調控網絡的構建將1.3中的穩健DEGs與1.4中的HLJDD作用靶點取交集，并繪制韋恩圖，這些交集靶點即為HLJDD延緩或抑制AS斑塊破裂的DEGs；然后，用Cytoscape3.7.2軟件構建中藥-成分-靶標-疾病網絡。

1.6 功能富集分析為了探究穩健DEGs和HLJDD-AS交集DEGs可能的功能作用，利用cluster-Profiler和enrichplot包對其進行GO和KEGG富集分析，并利用ggplot2和GOplot包進行可視化。

1.7 交集DEGs的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析將HLJDD-AS交集DEGs上傳至STRING數據庫（https：//string-db.org/），互作得分設置為最高置信度≥0.400，進行PPI分析，并用Cytoscape3.7.2軟件進行可視化。

1.8 Hub基因的篩選和Module分析利用MCODE插件 以 默認參數（degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100，k-score=2）為標準對PPI網絡進行Module分析，篩選最重要的子模塊。Hub基因由CytoHubba插件中的MCC、DMNC、EPC、Degree、MNC算法排序前10的基因的重疊基因組成。

1.9 分子對接 將Hub基因與其所對應HLJDD的活性成分進行分子對接。首先，從PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/）中檢索人源核心靶點的PDB ID號，用PyMOL去除水分子、配體等，Auto dock Tools加氫，然后轉換成pdbqt格式。其次，從PubChem數據庫中下載活性成分的分子結構，用ChemBio3D軟件進行優化。最后，利用Autodock Vina軟件進行分子對接，獲取結合能值，對接結果采用Discovery Studio Visualizer 4.5軟件進行可視化。結合能數值為負則提示活性成分與Hub基因可自由結合，數值越小說明對接體系越穩定，對接結果越可靠，本研究設定小于-5 kcal/mol的結合能代表結合具有顯著性，以此佐證活性成分與核心靶點之間作用關系的可信度。

2 結果

2.1 各數據集DEGs的篩選差異分析的結果顯示，E-MTAB-2055篩選出1 152個DEGs，其中上調572個，下調580個；GSE41571篩選出558個DEGs，其 中 上調126個，下調432個；GSE120521篩 選 出1 974個DEGs，其中上調1 152個，下調822個。圖1為3個數據集的火山圖和熱圖。

2.2 穩健DEGs的篩選及其富集分析RRA方法對3數據集進行整合分析后，共篩選出864個穩健DEGs，其中上調453個，下調411個。圖2A為前20個上調和下調穩健DEGs的熱圖。GO分析結果顯示，依據P＜0.05確定了793個GO條目；生物學過程（biological process，BP）條目為620條，主要涉及中性粒細胞的脫顆粒、活化、遷移、趨化作用、炎癥反應的調節、中性粒細胞介導的免疫反應、白細胞遷移等；分子功能（molecular function，MF）條目為64條，主要涉及膠原結合區、受體配體活性、趨化因子的活性等；細胞組分條目（cellular component，CC）為109條，主要涉及含細胞外基質的膠原、溶酶體腔、三級顆粒膜等（圖2B）。KEGG分析結果顯示，依據P＜0.05共映射出56條信號通路，包括吞噬體、溶酶體、細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、PPAR信號通路、細胞黏附分子等（圖2C）。

2.3 HLJDD活性成分及其作用靶點在TCMSP數據庫中以OB≥30%、DL≥18%為條件進行篩選，黃芩獲得36個活性成分，黃連為14個，黃柏為37個，梔子為15個，合并去重后為84個（表2）。將HLJDD的84個活性成分在TCMSP數據庫和Swiss Target Prediction數據庫進行靶點預測，剔除重復項后共獲得928個。

2.4 HLJDD-AS交集DEGs的獲取及其調控網絡的構建將RRA方法鑒定出的864個穩健DEGs，與網絡藥理學方法預測的HLJDD的928個作用靶點取交集，結果共有42個交集DEGs，其中上調32個，下調10個（圖3）；即HLJDD通過抑制32個上調DEGs表達，促進10個下調DEGs表達，延緩或抑制AS由穩定斑塊向破裂斑塊進展（圖4、表3）。

圖1 各數據集的火山圖和熱圖Fig.1 Volcano maps and heat maps of each data set

圖2 穩健DEGs及其富集分析Fig.2 Robust DEGs and its enrichment analysis

表2 HLJDD“中藥-活性成分-預測靶點”基本信息Tab.2 Basic information of HLJDD'Traditional Chinese Medicine-Active Ingredients-Predictive Target'

圖3 HLJDD作用靶點與穩健DEGs交集基因的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of intersection genes between targets of HLJDD and robust DEGs

2.5 交集DEGs的功能富集分析GO分析結果顯示，依據P＜0.05確定了392個GO條目，主要涉及膠原蛋白的分解代謝、組織重構、中性粒細胞的脫顆粒、活化、中性粒細胞介導的免疫反應、細胞外基質分解等（圖5A）。KEGG分析結果顯示，依據P＜0.05共映射出25條信號通路，主要包括溶酶體、鈣信號通路、PPAR信號通路、補體與凝血級聯反應等（圖5B）。

2.6 交集DEGs的PPI網絡構建、Hub基因的篩選和Module分析將交集DEGs導入STRING數據庫中進行PPI分析后，再用Cytoscape軟件繪制PPI網絡。如圖6A所示，該網絡包括35個節點、1 058條邊。通過MCC、DMNC、EPC、Degree、MNC算法，共篩選出7個Hub基因，模塊分析共篩選出2個子模塊，其中大部分Hub基因在模塊1中（圖6B～D）。

2.7 分子對接結果為了驗證HLJDD調控交集DEGs的可能性，本研究將Hub基因與其所對應的活性成分進行了分子對接。結果表明，提取出來的36對“活性成分-作用靶點”關系對中，HLJDD活性成分與7個Hub基因均存在不同程度的結合，結合自由能均小于-5 kcal/mol，提示兩者之間具有良好的親和力，結果具有一定的可信度（表4）。現將結合能小于-10對接結果進行可視化展示，見圖7。

圖4 HLJDD干預AS的“中藥-成分-靶標-疾病”網絡圖Fig.4 Network diagram of'Traditional Chinese Medicine-Ingredients-Target-Disease'of HLJDD Intervening AS

圖5 交集DEGs的功能富集分析Fig.5 Functional enrichment analysis of intersection DEGs

圖6 交集DEGs的PPI網絡構建、Hub基因的篩選和Module分析Fig.6 PPI network construction，Hub gene screening and Module analysis of intersection DEGs

表3 HLJDD調控交集DEGs在AS進展中的作用Tab.3 Role of HLJDD in regulating and intersecting DEGs in progress of AS

表4 HLJDD活性成分與作用靶點分子對接的結果Tab.4 Results of docking of active components of HLJDD with target molecules

圖7 對接結果模擬圖Fig.7 Simulation diagram of docking result

3 討論

AS是多種心腦血管疾病的共同病理基礎。所以AS的發生發展機制一直是研究熱點，尤其斑塊破裂的發生機制。隨著基因芯片和高通量測序技術的不斷發展，對于斑塊破裂的作用及機制的相關研究日漸深入。鑒于動脈斑塊由穩定到破裂的發生機制的復雜性，篩選出與斑塊破裂相關的有價值的差異基因對于識別診斷、治療及預后尤為必要。

本研究通過RRA法整合3個數據集后，共篩選出864個穩健DEGs，其中上調453個，下調411個。這些穩健DEGs主要通過補體和凝血級聯信號通路、鐵死亡、IL-17信號通路、白細胞跨內皮遷移、溶酶體途徑、PPAR信號通路、抗原處理和呈遞、TGF-β信號通路等參與斑塊破裂的病程變化。與斑塊破裂相關的重要穩健DEGs中，目前有研究證實補體C1q子成分A（C1QA）、補體C1q子成分B（C1QB）等作為補體系統的一部分，當補體C1q水平的顯著降低時可能是導致AS斑塊不穩定或破裂的一個促成因素［9］，但其通過與ApoE形成復合物可以減輕無法解決的炎癥［10］；血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HMOX1）與纖維帽較薄和血栓形成破裂斑塊有關［11］；基質金屬蛋白酶表達水平與斑塊穩定程度及斑塊纖維帽厚度呈負相關［12］，其中基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）通過炎癥反應在介導斑塊破裂中發揮重要作用［13］；纖維帽中G蛋白信號通路調節蛋白5（G protein signaling pathway 5，RGS5）的缺失促進了斑塊破裂的進程［14］；脂肪細胞增強結合蛋白1（adipocyte enhancer binding protein 1，AEBP1）是一種新型巨噬細胞促炎介質，可以通過介導巨噬細胞浸潤加速AS病程變化［15］。與斑塊破裂相關的信號通路中，研究發現鐵死亡是一種主要由鐵依賴性脂質過氧化介導的調節性細胞死亡，抑制鐵死亡能夠減輕內皮細胞的脂質過氧化和內皮功能障礙，減輕AS程度［16］；脂質過氧化和鐵沉積是晚期AS斑塊的共同特征，故推測鐵死亡參與了斑塊不穩定的發展進程。IL-17是由T細胞或一個獨特的輔助性T細胞亞群產生的細胞因子，可通過增加血管平滑肌細胞的凋亡水平，促進易損斑塊的破裂［17］；過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）是核受體超家族的成員，作為配體誘導轉錄因子，研究發現通過AMPK-PPARα通路介導巨噬細胞極化參與了AS斑塊穩定性調節［18］；TANG等［19］研究發現通過加劇TGF-β/ROCK1調節的內皮間質轉化進展，亦可以導致頸動脈斑塊的脆弱性。此外，有報道指出在類風濕關節炎和Ⅰ型糖尿病患者中，AS負擔和斑塊破裂的脆弱性增加［20-21］。總之，以上相關文獻的報道從側面證實了本研究結果的可靠性和科學性。

現代醫學從微觀層面可以闡釋出斑塊破裂的發生機制與重要相關基因，而傳統醫學有別于現代醫學的精準分子致病理論。AS屬于發生在脈管上的病變，因于“毒邪最易腐筋傷脈”，與AS斑塊破潰、出血及大量炎癥因子浸潤等病理變化有關，故現代醫家認為斑塊破裂的致病因素乃是中醫“毒”邪［22］。既有“毒者，邪氣蘊結不解之謂”；又有“其久心痛者，是心之支別絡脈，為風邪冷熱所乘痛也，故成疹不死，發作有時，經久不瘥也。”可知毒邪有內毒與外毒之分，而現代醫家偏向于AS的發生與內毒緊密相關。內毒主要因臟腑功能失衡，氣血紊亂，使得機體內代謝產物不能及時重新利用或排出，累積日久，敗壞形體而化生。如陳可冀院士根據中醫關于瘀、毒致病特點，具有廣泛性、頑固性、趨內性、趨本性、兼夾性等，類似于AS易損斑塊炎性反應及血栓的形成，提出“瘀毒致易損斑塊”的觀點［23-24］。王永炎院士根據“毒損絡脈”的理論學說及病程進展，將病絡分為絡弛、絡結、絡破三種狀態，其中絡破即為斑塊破裂，指絡壁受損，脈中血液溢出的病理狀態［25-26］。此外，蘇文全等［27］已提出了相似學說“脈郁毒損”，即脈郁生毒、毒損脈絡，指出毒損是AS病程中發展變化的關鍵環節。不同醫家根據AS的病機演變提出了瘀毒、痰毒、熱毒學說，而熱毒是促進斑塊破裂的病機基礎［28］。故有學者倡導在動脈斑塊破裂之際應加重清熱解毒通脈之品［29］。

將HLJDD與穩健DEGs取交集靶點，發現HLJDD通過抑制32個上調DEGs的表達，促進10個下調DEGs的表達，延緩或抑制AS由穩定斑塊向破裂斑塊的進展。經GO富集及KEGG富集分析，發現HLJDD可通過調節膠原代謝、組織重構、免疫反應、血液循環調節等，參與鈣信號通路、細胞凋亡、流體剪應力與AS、PPAR信號通路及Apelin信號通路等信號途徑。目前研究證實抑制KCa3.1通道可以有效延緩動脈斑塊破裂的進展［30］；Apelin-APJ信號參與調節類風濕關節炎斑塊穩定性介質水平的改變［20］。此外，研究發現與無斑塊破裂動脈相比，有斑塊破裂的動脈組織中存在高壁剪切應力（wall shear stress，WSS），其導致斑塊破裂的機制可能與誘導內皮細胞行為的特異性改變及加劇炎癥和刺激AS脂質核心有關［31-32］。這些不僅補充了HLJDD對斑塊破裂的治療靶點，還展示出其以多環節、多途徑方式參與斑塊破裂的調節作用，同時以方測證，以證驗因，上述靶點和功能富集結果可能是AS中醫“毒損脈絡”“毒致易損斑塊”的科學內涵，為進一步中醫學從毒論治AS提供了客觀依據。

經Hub基因的篩選分析，推測HLJDD主要通過下調基因MMP8、CTSD、SPP1、PLAU、CTSB、CTSS、CTSL，發揮抑制或緩解斑塊破裂病理過程。其中基質金屬蛋白酶8（matrix metalloproteinase 8，MMP8）不僅參與膠原降解，提高斑塊易損指數，還被鑒定為防止斑塊破裂的良好靶標［33-34］。CTSD、CTSB、CTSS、CTSL屬于組織蛋白酶，通過凝血、免疫反應、補體激活、脂肪生成、凋亡等一系列途徑，對改善AS進展或斑塊破裂發揮至關重要的作用［35-36］。重組人分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）又稱骨橋蛋白，是一種分泌型多功能糖蛋白，主要由內皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞分泌，參與礦物質沉積和斑塊鈣化生物過程，研究發現SPP1在破裂斑塊中的表達比穩定斑塊中更為顯著［37］。尿激酶-纖溶酶原激活物（urokinase-plasminogen activator，PLAU），亦稱為uPA，是一種絲氨酸蛋白水解酶，通過調控巨噬細胞浸潤參與AS斑塊破裂［38］。目前研究證實HLJDD通過降解膠原纖維、改善血液流變學紊亂、促進膽固醇流出及調節巨噬細胞炎癥浸潤等延 緩AS進 程［39-42］。基 于Hub基 因 的 篩 選 可 知，HLJDD不僅可以通過下調這些關鍵靶點改善斑塊破裂病理變化，還進一步深化了HLJDD穩定斑塊及延緩斑塊破裂的分子機制。

通過分子對接技術進一步預測Hub基因與其所對應的活性成分的結合關系，結果顯示36對“活性成分-靶點蛋白”關系對的結合自由能均小于-5.0 kcal/mol，這提示HLJDD活性成分與斑塊破裂的潛在靶點之間具有良好的結合力；其中kihadanin A、蕓香堿（rutaecarpine）、（R）-氫化小檗堿［（R）-Canadine］、（S）-氫化小檗堿［（S）-Canadine］、棕櫚酸酯A（Palmidin A）與其對應靶點蛋白CTSB、CTSS、CTSL、MMP8的結合自由能均小于-10 kcal/mol，表現出最強的結合能力，具有進一步深入開發研究的價值。

本研究運用生物信息學的方法發現了在AS由穩定斑塊發展至破裂斑塊過程中的一些DEGs以及HLJDD發揮延緩或抑制功效的作用機制，但仍有一些局限性。本文雖運用RRA法分析了多個數據集，但由于數據庫中可獲得的數據集有限，同時每個數據集中滿足研究條件的樣本較少，最終導致本研究納入的樣本量有限；生信預測的結果雖進行了分子對接實驗的驗證，但其結果仍需要進一步在后續的研 究 中 進 行 佐 證。總 之，MMP8、CTSD、SPP1、PLAU、CTSB、CTSS、CTSL在AS破裂斑塊中發揮著重要作用，HLJDD可通過抑制其表達來延緩或抑制AS由穩定斑塊發展至破裂斑塊，研究結果可為進一步探討AS破裂斑塊的分子機制以及HLJDD干預其進展提供新的思路和切入點，并為中醫從毒論治AS易損斑塊提供一定的科學依據。