內(nèi)蒙古漢族人群多發(fā)性硬化與HLA-DRB1基因型的相關(guān)性研究①

米飛躍 王蒂媛 殷旭華 郭 燕 韓建文（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種自身免疫介導(dǎo)的炎性脫髓鞘疾病，目前多認(rèn)為該疾病的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，遺傳易感基因受到越來越多學(xué)者的重視。其中人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）多態(tài)性是重要的遺傳因素。HLA基因位于6號(hào)染色體短臂的6p21.3區(qū)，由一系列緊密連鎖的基因座組成，在抗原呈遞和免疫應(yīng)答中起重要作用。諸多研究中發(fā)現(xiàn)不同人種、不同地區(qū)和不同種族與MS相關(guān)的HLA等位基因型并不完全相同，反映出某些遺傳背景差異。其中HLA-DR15就明確增加了高加索人種MS的易感性［1-2］。目前，研究最多的是DQB1、DPB1、DRB1等Ⅱ類基因，它們主要集中在HLA的第二外顯子，具有高度的多態(tài)性，且與MS的易感性密切相關(guān)。內(nèi)蒙古漢族由于所處地理環(huán)境不同、飲食結(jié)構(gòu)差別，以及不同種族之間結(jié)合所致的遺傳背景差異，可能影響本地區(qū)漢族MS人群的遺傳基因多態(tài)性，其中DQB1和DPB1等位基因已有本地區(qū)研究者做過檢測，故此次僅針對(duì)性地采用高分辨分型的方法檢測HLA-DRB1基因型，分析其與MS的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 觀察對(duì)象40例內(nèi)蒙古漢族MS患者，男12例、女28例，年齡21～57歲，平均（40.68±10.0）歲，所有患者均符合2010年的MacDonald臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，且隨訪1.5年。40例內(nèi)蒙古漢族健康對(duì)照者，男13例、女27例，年齡22～59歲，平均年齡（41.5±10.9）歲，已排除其他自身免疫病、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病。兩組間年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.2 試劑與儀器試劑盒：SeCore DRB1 Locus Sequencing Kit；5810R離 心 機(jī)（eppendorf公 司)；9700 PCR儀、3730XL測序儀（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取從全部入組對(duì)象中，抽取5 ml外周血，EDTA抗凝，-80℃保存，按說明書提取基因組DNA。

1.2.2 HLA-DRB1等位基因測序?qū)LA-DRB1基因進(jìn)行高分辨率分型，采用美國Atria Genetics研發(fā)的基于測序的方法（SBT）。實(shí)驗(yàn)步驟：①樣品準(zhǔn)備；②PCR擴(kuò)增；③擴(kuò)增后產(chǎn)物處理；④測序反應(yīng)；⑤乙醇沉淀；⑥毛細(xì)電泳檢測；⑦分析；⑧確認(rèn)結(jié)果。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析運(yùn)用測序分析軟件處理收集的原始數(shù)據(jù)并創(chuàng)建測序文件。采用uTYPETMHLA測序分析軟件，處理測序文件同時(shí)創(chuàng)建HLA分型報(bào)告。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。基因頻率用直接計(jì)數(shù)法，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；理論數(shù)＜5時(shí)，改Fisher精確概率法。用Bonferroni法（Pc）校正P值，將實(shí)驗(yàn)中檢測到的基因數(shù)乘以P值，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相對(duì)危險(xiǎn)度（RR）表示HLA基因?qū)τ贛S的危險(xiǎn)程度。

2 結(jié)果

在MS患者及對(duì)照組中，共檢測到25個(gè)HLA等位基因片段，其中表1列出8個(gè)基因片段，其他所檢測到的基因片段經(jīng)檢驗(yàn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MS組患者15：01等位基因頻率（45.0%）高于ZC組（12.5%）（P=0.001，RR=1.591），經(jīng) 校 正 后Pc為0.011，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MS組04：05等位基因頻率高于對(duì)照組，11：01和12：02等位基因頻率低于ZC組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 MS組與ZC組等位基因型頻率比較［例（%）］Tab.1 Comparison of allele frequency between MS group and ZC group［n（%）］

3 討論

目前HLA基因占遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素的10%～40%，相比其他基因，被認(rèn)為是與MS關(guān)聯(lián)強(qiáng)度最大的遺傳因素［3］。不同種族和地區(qū)中，與MS相關(guān)的HLA等位基因型也不完全相同，顯示出遺傳異質(zhì)性。

大多數(shù)西方研究顯示HLA-DRB1*15：01與MS發(fā)病顯著相關(guān)，與正常人群相比，攜帶DRB1*15：01基因者罹患MS的風(fēng)險(xiǎn)增加3倍，使之成為MS最強(qiáng)的遺傳危險(xiǎn)因素［4-5］。在歐洲人群中DRB1*15：01等位基因頻率為3%～20%，從南歐到北歐患者群隨易感性的增加而增加［6］。傳統(tǒng)型MS（C-MS）與DRB1*15：01相關(guān)聯(lián)，這符合在白人中的研究結(jié)果［7］，而日本的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)-脊髓型MS（OS-MS）患者中HLA-DPB1*0501基因呈高表達(dá)［8］。

在一項(xiàng)2008年對(duì)我國北方漢族人群的研究中表明，DR15可能是MS的易感基因［9］。西方人的MS以大腦、腦干病損為主（西方型MS），而我國和日本發(fā)現(xiàn)脊髓和視神經(jīng)受損較為常見（亞洲型MS）。馬建軍等［10］對(duì)河南人群的研究認(rèn)為亞洲型MS與DRB1*15：01無關(guān)，同時(shí)研究結(jié)果表明歐洲人類型的MS與DRB1*15：01相關(guān)。通過SBT，吳曉牧等［11］認(rèn)為我國南方漢族人群C-MS可能與DRB1*12：02相關(guān)，OS-MS則與DRB1*04：06相關(guān)聯(lián)，而我國北方漢族人群中部分OS-MS的易感基因可能是DRB1*12［12］。在這項(xiàng)研究中運(yùn)用SBT法，對(duì)內(nèi)蒙古漢族MS病例組和健康對(duì)照組進(jìn)行HLA分型，這種分型方法的優(yōu)點(diǎn)有：是目前分辨率最高的基因分型法，分型結(jié)果能精確到小數(shù)點(diǎn)后4位；彌補(bǔ)了先前PCR-序列特異性寡核苷酸探針、序列特異性引物等分型方法中結(jié)果的不確定，僅能對(duì)一種或者兩種等位基因進(jìn)行分型的缺點(diǎn)。本研究采取測序方法對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象所有DRB1等位基因進(jìn)行分型分析，結(jié)果顯示DRB1*15：01等位基因頻率MS組（45.0%）顯著高于健康對(duì)照組（12.5%），與大多數(shù)西方研究結(jié)論一致，提示DRB1*15：01可能是內(nèi)蒙古漢族人群MS的易感基因，04：05等位基因頻率高于正常對(duì)照組，但經(jīng)檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能需要更大的樣本證實(shí)。另外，本研究選取的患者均為確診的MS，除外視神經(jīng)脊髓炎患者，但結(jié)果卻與西方型MS相似，而與其他地區(qū)的漢族人群的易感基因有差異，進(jìn)一步提示了MS與HLA的相關(guān)性存在高度的異質(zhì)性。

總之，根據(jù)國內(nèi)的研究成果，尚不能得出一致的結(jié)論，歸結(jié)原因可能有以下幾點(diǎn)：遺傳基礎(chǔ)和地理環(huán)境不同；樣本量多少、檢驗(yàn)水準(zhǔn)和分型方法的差異。