EMS誘變對不同基因型胡麻種子萌發及M3農藝性狀和品質性狀的影響

王 斌,趙 利,侯靜靜

(甘肅省農業科學院 作物研究所,蘭州 730070)

胡麻,也叫油用亞麻,是中國西北和華北地區重要的油料作物之一。亞麻籽中含有的木酚素、脂質、蛋白質、膳食纖維和微量營養元素,亞麻籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸,具有預防和治療心腦血管、糖尿病,提高免疫力、抗癌和抗氧化等生理功能,具有極高的營養價值和醫療保健功能[1]。2019年中國亞麻種植面積23.3 萬hm2,亞麻總產量為34萬t,但進口的亞麻籽總量達到42.7萬t,亞麻籽進口量已遠遠超過國內產量[2]。隨著人們健康意識的提高,對亞麻籽功能活性成分在營養保健和醫藥等領域的深入研究,胡麻籽的市場需求會持續增長。亞麻主要種植在高寒干旱地區,產量低,農民種植積極性不高。應該針對不同用途選育適合深加工的優良品種,增加其經濟附加值。但是胡麻種質資源遺傳基礎狹窄,國內胡麻育種長期使用骨干親本使得品種遺傳多樣性較低,品種選育難以取得較大的突破[3]。

通過化學劑誘導作物可以產生大量變異性狀,比常規雜交育種效率高,選擇生產上可利用的性狀和基因,具有獨特的優勢。EMS(Ethyl methane sulfonate,甲基磺酸乙酯)是一種高效、穩定和良好的化學誘變劑,誘變效果好,目前在花生[4]、大豆[5]、油菜[6]等油料作物上廣泛應用。EMS化學誘變通常誘發C/G 到T/A 轉換的點突變,主要是將DNA 鳥嘌呤的N7 位置烷基化[7],出現鳥嘌呤N7 烷基活化,糖苷鍵斷裂脫去鳥嘌呤,導致基因復制時堿基錯位,產生突變,或者是烷基化的鳥嘌呤和胸腺嘧啶配對,產生突變,最終引發基因突變。EMS具有誘變效率高、材料損傷較小及適用范圍廣等優點。利用EMS 誘變構建突變體庫已成為獲得突變體、創新種質和育種的有效手段[8]。于瑩等[9]在亞麻上研究表明,高濃度EMS誘變亞麻成苗率較高,但大多數是不育植株,導致種子產量較低。EMS 誘變在胡麻的報道較少,本研究設置不同誘變濃度和時間,探討EMS誘變對不同基因型胡麻品種的誘變效應,并對M3種子的農藝性狀和品質性狀進行分析,為胡麻新品種選育和遺傳改良提供優異資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試驗的胡麻品種為‘輪選3 號’‘CDC SoRel’‘張亞2號’‘C9625’和‘內亞6號’共5個品種,其中‘輪選3號’‘CDC SoRel’‘C9625’籽粒顏色為褐色,‘張亞2號’和‘內亞6號’籽粒顏色為淺黃色,由甘肅省農業科學院作物研究所提供。

1.2 主要試劑及藥品配置

化學誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS),購自Sigma公司。配置0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液,然后調試p H 至7.0。將磷酸鹽緩沖液作為溶劑,配制0(CK)、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%的EMS溶液(V/V),現配現用。

1.3 試驗設計及處理

試驗設5個品種(A)、4個處理時間(B)、和5個誘變濃度(C),因素及水平如表1 所示。試驗共20個處理,以磷酸鹽緩沖液為對照(CK)。每份材料選取飽滿種子1 000粒置于培養皿中,在通風櫥中按不同處理進行浸種,然后用無菌水沖洗種子10次。上述處理后得到的種子為M0,將M0種子30粒于雙層濾紙的培養皿中發芽,統計發芽率。

表1 試驗因素與水平Table 1 Experiments factors and levels

M0種子于2017年播種于甘肅省農業科學院蘭州試驗地,每個處理種兩行,行長2 m,每行播種300粒。田間調查出苗期,出苗后分2次調查并(間隔1 周)統計出苗率。M1 種子于2018年在甘肅省農業科學院蘭州試驗地按單株編號的順序全部播種;M2種子當年進行南繁加代,按編號每個材料種1 行。M3 種子于2019 年在甘肅省景泰縣按行播種,每個處理取20株進行考種,考察株高、工藝長度、分莖數、分枝數、單株果數、千粒質量、單株產量;利用瑞士Perten公司生產的DA 7200型近紅外品質分析儀,進行品質成分分析,測定指標包括粗脂肪含量、脂肪酸組分(主要為棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油酸)和木酚素含量。

發芽率=第7天發芽的種子數/總種子數×100%

出苗率=出苗數/播種的種子數×100%

相對出苗率=出苗率/對照的出苗率×100%

1.4 數據處理

采用Excel 2010和DPS 7.5軟件對數據進行統計分析。用單因素試驗統計分析方法,對胡麻不同處理的試驗數據進行差異顯著性檢測。

2 結果與分析

2.1 EMS處理對不同基因型胡麻種子發芽率的影響

由圖1 可見,隨著EMS 處理濃度的增加和時間的延長,‘輪選3號’發芽率由最高93.33%降到最低51.11%,‘CDC SoRel’和‘C9625’由最高91.11%降到最低71.67%和72.22%,‘內亞6號’由最高85.56%降到最低37.38%,‘張亞2號’由最高67.78%降到最低4.44%,變化趨勢基本都是由高到低。在不同品種間,尤其是不同籽粒顏色的品種間,EMS處理對發芽率的影響存在顯著差異。對籽粒顏色褐色的品種‘輪選3 號’‘CDC So Rel’‘C9625’發芽率影響,在不同濃度和時間處理下,發芽率呈緩慢下降趨勢,而對淺黃色品種‘張亞2號’和‘內亞6號’的發芽率影響,呈快速下降趨勢。‘張亞2 號’對EMS 處理最敏感,其次是‘內亞6號’,‘輪選3號’最不敏感。

圖1 EMS處理不同基因型胡麻種子發芽率Fig.1 Seed germination rate of different flax varieties under EMS treatment

2.2 EMS處理對不同基因型胡麻相對出苗率的影響

EMS誘變劑損傷種子活力,抑制萌發;處理時間越長,誘變濃度越高,相對田間出苗率越低;同一濃度水平上處理時間越長,同一時間水平上誘變濃度越高,田間相對出苗率越低(表2)。EMS處理對不同品種相對出苗率的影響存在顯著差異,在不同品種間、不同處理時間和不同處理濃度下均呈顯著差異(P＜0.05)(表2)。不同品種間,‘輪選3號’相對出苗率高于其他品種,其次是‘CDC So Rel’和‘C9625’,而‘內亞6號’‘張亞2號’相對出苗率最差。‘CDC So Rel’和‘C9625’在處理B3C4、B3C5、B4C4、B4C5基本沒有出苗,而敏感品種‘張亞2號’‘內亞6號’在濃度較高和 處理時間較長的情況下,基本沒有出苗。

表2 EMS處理不同基因型胡麻品種相對出苗率Table 2 Relative emergence rate of different flax varieties under EMS treatment

為了研究不同基因型胡麻品種、EMS處理時間和濃度3因素對胡麻相對出苗率的影響,進行了方差分析和多重比較。由表2可知,品種、處理時間、濃度、品種×時間、品種×濃度、時間×濃度、品種×時間×濃度的F 值均達到顯著水平(P＜0.01),說明每個因素對相對出苗率的影響都是顯著的,不同品種、濃度和時間存在交互作用。而不同基因型的品種,在同樣的濃度和時間水平下出苗率也是顯著變化的。可見,不同基因型的胡麻品種對EMS誘變的響應是不同的。從平方和占比可知,對相對出苗率影響最大的因素是品種,其次是處理濃度和處理時間。

2.3 EMS處理對M3農藝性狀的影響

從表3可以看出,EMS處理對不同胡麻品種M3農藝性狀的影響存在差異。‘輪選3號’處理B4C2和B4C3,‘張亞2 號’處理B2C1 和B1C3,‘C9625’處理B3C1、B4C1、B2C2 株高低于對照外,其余處理均比對照高;‘CDC SoRel’和‘內亞6號’各處理均高于對照。‘輪選3號’‘張亞2號’和‘內亞6號’各處理工藝長度均比對照高,‘CDC SoRel’各處理均比對照高。‘CDC SoRel’各處理分莖數均比對照高,‘內亞6號’處理B1C2比對照低,其余處理均比對照高,‘C9625’‘輪選3號’和‘張亞2 號’各處理分莖數比對照有高有低。‘CDC So Rel’和‘內亞6號’各處理分枝數均比對照高,‘張亞2號’處理B1C2高于對照外,其余處理均比對照低;‘輪選3號’處理B4C3和B3C3,‘C9625’處理B1C5低于對照外,其余處理均比對照高。‘CDC So Rel’和‘內亞6號’各處理單株果數均比對照高,‘張亞2號’處理B2C1高于對照外,其余處理均比對照低;‘輪選3號’和‘C9625’各處理比對照有高有低。‘張亞2號’各處理比對照降低了千粒質量,‘C9625’各處理均比對照高,而其他品種各處理比對照有高有低。‘CDC SoRel’和‘內亞6號’各處理比對照提高了單株產量,‘張亞2 號’各處理比對照降低了單株產量,‘輪選3號’和‘C9625’各處理比對照有高有低。

表3 EMS處理不同基因型胡麻品種M3代農藝性狀Table 3 Agronomic traits of M3 generation in different flax under EMS treatment

2.4 EMS處理對M3品質性狀的影響

不同處理對不同胡麻品種品質性狀的影響見表4。‘輪選3 號’粗脂肪含量只有B1C1、B1C2處理高于對照,其余均低于對照;而木酚素含量各處理均高于對照,亞麻酸含量在處理B1C1 和B3C3高于對照,其余處理均低于對照;處理B1C1比對照降低了油酸含量和棕櫚酸含量,其余各處理均比對照高;各處理均比對照降低了硬脂酸含量。‘CDC SoRel’在處理B1C1、B1C2、B1C3 比對照提高了粗脂肪含量,在處理B1C3、B3C1比對照降低了木酚素含量,在處理B1C1、B1C2比對照提高了亞麻酸含量;在處理B2C2比對照降低了亞油酸含量,其余處理提高了亞油酸含量。‘張亞2號’在處理B1C1、B2C1比對照提高了粗脂肪含量,在處理B1C1比對照降低了木酚素含量,在處理B1C1和B2C1提高了亞麻酸含量;比對照降低了亞油酸含量,提高了硬脂酸含量。‘C9625’在處理B2C2、B3C1比對照提高了粗脂肪含量,在處理B1C3、B1C5、B2C1比對照提高了木酚素含量,在處理B1C5、B2C2、B3C1均比對照提高了亞麻酸含量。‘內亞6號’各處理比對照降低了粗脂肪和亞麻酸含量,提高了硬脂酸含量和油酸含量;在處理B4C1比對照提高了亞油酸含量,其余處理降低了亞油酸含量,提高了棕櫚酸含量;在處理B1C2比對照降低了木酚素含量,其余處理提高了木酚素含量。

表4 EMS處理下不同基因型胡麻品種M3代品質性狀Table 4 Quality traits of M3 generation in different flax varieties under EMS treatment

2.5 不同胡麻品種M3代品質優異突變材料的篩選

對M3代各處理突變材料品質變異情況進行分析,統計粗脂肪、木酚素和亞麻酸含量分別≥42%、≥10 mg/g和≥60%的材料數(表5)。其中‘內亞6號’粗脂肪含量≥40%的材料有24份,沒有高于42%的材料;分別從‘輪選3號’‘CDC So Rel’‘C9625’選擇到亞麻酸含量高于55%的材料39份、40份和5份,但沒有高于60%的材料。從1 375份M3材料中選擇出高粗脂肪含量材料155份、高木酚素含量材料45份、高亞麻酸含量的材料26份,分別占總數的11.27%、3.27%和1.89%。其中從‘輪選3號’中選擇到高粗脂肪含量的材料比較多,從‘張亞2號’和‘內亞6號’選擇出亞麻酸含量高的材料比較多。

表5 不同胡麻品種M3代品質優異突變材料的篩選Table 5 Selection of superior mutants of M3 generation in different flax varieties

2.6 不同基因型胡麻品種最佳EMS誘變條件篩選

以EMS處理時間X1和濃度X2為自變量,田間相對出苗率為因變量Y,利用線性回歸方程計算最佳EMS誘變條件。由于EMS 處理對不同粒色胡麻品種在發芽率和相對出苗率上存在顯著差異,因此根據籽粒顏色通過不同線性回歸方程計算最佳EMS 誘變條件。褐色籽粒Y1=1.254 5—0.055 7X1—0.537 1X2;淺黃色籽粒Y2=0.678 3—0.042 3X1—0.342 8X2,得到褐色籽粒胡麻品種的最佳誘變條件(0.6%,4 h),淺黃色籽粒品種為(0.3%,4 h)。為了獲得更有利的變異條件,通過統計不同處理品質高于對照的株樹,發現較低濃度和處理時間可以提高胡麻粗脂肪和亞麻酸含量,‘輪選3 號’‘CDC SoRel’在處理條件(0.6%,2 h)獲得有利變異更多,‘C9625’在(0.6%,4 h)時獲得有利變異多,與回歸方程結果一致;在誘變條件(0.6%,4 h)時田間相對出苗率更接近50%,綜合品質變異統計結果,最終得到褐色籽粒胡麻品種的最佳誘變條件(0.6%,4 h或2 h)。淺黃色籽粒品種回歸方程結果與變異統計結果一致,最佳誘變條件為(0.3%,4 h)。

3 討論

本研究表明,不同EMS 處理對種子萌發以及幼苗生長有顯著的抑制作用,EMS 濃度越高處理時間越長,抑制作用就越顯著,發芽率和相對出苗就越低,與已有研究結果一致[10-12]。許燕等[13]研究表明。隨著EMS 濃度的增大,M1 種子存活率下降,與本研究結果一致。本研究表明,不同品種對不同EMS誘變處理反應敏感度不同,尤其不同籽粒顏色的品種間,分析原因可能與不同籽粒顏色胡麻品種特性有關,種子萌發時胚發育能力有差異;也可能與不同顏色種皮厚度或色素層不一致導致藥物滲透性有差異,還需實驗進一步驗證。方差分析表明,不同品種、濃度和時間存在交互作用,對相對出苗率影響最大的因素是品種和處理濃度,與楊秀麗等[14]利用EMS誘變不同基因型花生品種的結果一致。

本研究通過EMS處理提高了M3代材料的株高、工藝長度、分枝數、單株果數和單株產量,千粒質量影響不明顯,但不同品種和處理間也存在差異。這些變異有正向的,也有負向的,從中可能篩選出對育種有用的突變體,對今后胡麻高產育種具有積極意義。在油菜上,楊建勝等[15]研究表明,M1農藝性狀除分枝數增加外,株高、主花序有效角果數、全株有效角果數、角果長度、角果粒數、千粒質量等均顯著降低,與本研究結果不一致,可能與不同作物的誘變效應不確定性有關;黎詩艷等[16]研究表明,EMS 對苦蕎株高以及產量方面影響顯著,隨著處理濃度的增加,各個指標呈遞減趨勢。本研究EMS 對產量性狀的影響結果,還需連續多代測定驗證。王允等[17]通過研究花生EMS誘變M2種子的品質性狀,發現誘變可以改變花生的品質,發現了粗脂肪含量高于對照的突變體。許燕等[13]EMS 誘變花生‘珍珠紅1號’篩選獲得9個優良M5突變系,其中有4個表現出產量高、品質優異、綜合性狀優良等特點。本研究對M3種子的品質性狀進行分析,發現EMS誘變可以改變胡麻的品質,不同品種間、不同處理間品質性狀變異存在差異,誘變效應有正有負。從‘輪選3號’‘CDC SoRel’‘張亞2 號’可以看出,較低濃度和處理時間可以提高胡麻粗脂肪和亞麻酸含量,與陳碧云等[6]在油菜上研究結果一致。

從1 375份M3代材料中選擇出高粗脂肪材料155份、高木酚素含量材料45份、高亞麻酸含量的材料26份,說明通過EMS誘變產生新的優異突變種質是可行的。這些豐富的變異類型,為胡麻進一步的遺傳改良提供了新的基因資源。魏中艷等[18]通過測定EMS誘變‘中品661’M2～M7籽粒的蛋白質含量表明,高蛋白含量突變體在連續選擇過程中,蛋白含量呈下降趨勢;可能與高蛋白含量個體多為雜合狀態,需要選擇純合高蛋白含量個體,才能創制出穩定的高蛋白種質。因此,在胡麻高代材料選擇純合單株測定品質,有利于選擇出性狀穩定、品質好的材料。袁潤勤等[19]利用SSR 和SRAP標記檢測‘中雙9號’M3株系,結果表明138個株系沒有完全按表型突變聚在一起,但產生了可在分子水平上檢測的突變,而且誘變后代材料之間存在廣泛的遺傳差異。本試驗主要調查了誘變后代的農藝性狀變化及M3種子的品質變化情況,并未對這些突變體產生的機理及其遺傳物質的改變進行研究,需進一步從分子水平上檢測突變體遺傳物質的變化情況,將有利于深入認識EMS 對胡麻的誘變效應,為新品種選育奠定基礎。

4 結論

通過EMS 誘變不同基因型胡麻品種,發現不同胡麻品種間,尤其在不同籽粒顏色的胡麻品種間,發芽率和田間相對出苗率存在顯著差異。通過不同基因型胡麻品種、EMS處理時間和濃度3因素分析,對胡麻相對出苗率影響最大的因素是品種,其次是處理濃度和處理時間。最終得到褐色胡麻品種的最佳誘變條件(0.6%,4 h 或2 h),淺黃色籽粒品種最佳誘變條件(0.3%,4 h)。從1 375份M3代材料中選擇出高粗脂肪材料155份、高木酚素含量材料45份、高亞麻酸含量的材料26份。