枸杞果實中乙唑螨腈檢測方法研究

牛 艷，陳 翔，楊 靜，吳 燕，趙子丹，劉 霞

（農業農村部枸杞產品質量監督檢驗測試中心，寧夏農產品質量標準與檢測技術研究所，寧夏回族自治區農產品質量標準研究與評價重點實驗室，寧夏 銀川 750002）

枸杞（Lycium barbarumL.）是我國傳統名貴中藥材，能夠有效清除人體內的自由基，具有增強免疫力、防衰老、抗腫瘤、抗氧化、提高有益菌水平、促進神經系統損傷的功能性恢復等多方面的藥理作用[1-5]。我國枸杞的種植面積逐年擴大，逐漸形成一定的產業規模。生產過程中為了防治枸杞螨蟲等問題，通常會使用殺螨劑。乙唑螨腈是新型吡唑類殺螨劑[6-8]，通過代謝成羥基形式而活化產生活性，阻礙電子傳遞，從而破壞氧化磷酸化過程，具有觸殺作用，對柑橘全爪螨[9-10]、始葉螨、蔬菜朱砂葉螨、花卉二斑葉螨[11]、荔枝葉螨[12]、西瓜二斑葉螨[13-14]、琯溪蜜柚紅蜘蛛[15]等有較好的防治效果。在我國乙唑螨腈已在柑、橘、蘋果等果蔬上獲準登記使用，并已制定了相關的最大殘留限量（MRL）[16]，但尚未制定檢測方法標準。關于乙唑螨腈的檢測分析方法有液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法，并已在少量作物上進行殘留動態研究[17-21]，而在枸杞果實中乙唑螨腈檢測方法的研究目前尚未見報道。

本研究建立了以乙腈為提取溶劑，經N-丙基乙二胺（PSA）及石墨化碳黑（GCB）凈化，采用液相色譜-質譜/質譜（UPLC-MS/MS）法測定枸杞中乙唑螨腈的分析方法，操作簡單，結果準確。檢測枸杞中乙唑螨腈殘留，旨在為我國制定乙唑螨腈在枸杞中的農藥最大殘留限量提供分析方法，對枸杞產業的發展也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

枸杞，品種為寧杞7號，采自寧夏農林科學院園林場試驗基地。取1 kg鮮果作為直接測試樣品，另取2 kg鮮果制干（采后的新鮮枸杞，經2%的食用級碳酸鈉或碳酸氫鈉水溶液浸漬5～10 s脫蠟，瀝干后晾曬制干），作為枸杞干果試驗樣品。

乙唑螨腈標準品（CAS號1253429-01-4，純度99%），德國HPC公司；乙腈、甲醇（色譜純），美國默克試劑公司；氯化鈉（分析純，140℃烘烤4 h），國藥集團化學試劑有限公司；N-丙基乙二胺吸附劑（40～63μm），石墨化碳黑（120～400目），美國安捷倫公司；水為去離子水。

1.1.2 儀器與設備

Thermo TSQ Quantum型超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀，美國賽默飛公司；Heal Force Neofuge 18R型高速離心機，香港力康發展有限公司；MS3 digital型渦流混合器，德國IKA公司；PL202-L型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SMT-Y09型組織搗碎機，深圳斯瑪特智能電器發展有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器，金壇榮華儀器制造有限公司；超純水機、精密移液槍以及其他實驗室常用儀器設備。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

將鮮、干枸杞樣品于-18℃冷凍冰箱中保存。試驗時將鮮、干枸杞樣品取出，鮮樣用高速組織搗碎機打漿，干樣用高速萬能粉碎機（可加少量的液氮）粉碎（30 g樣品粉碎時間為30 s），分別置于樣品瓶中，-18℃冷凍備用。

1.2.2 樣品的提取與凈化

分別稱取枸杞鮮果10.00 g、干果5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，在水浴恒溫振蕩器中振蕩40 min，加入5.0 g氯化鈉，蓋上蓋子，振搖約1 min，放入離心機，于4 000 r/min離心5 min，吸取2 mL上清液于15 mL離心管中（提前稱好50 mg PSA和10 mg GCB）渦旋凈化后過0.22μm濾膜，用液相色譜-質譜/質譜法測定。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：1μL；流動相梯度見表1。

表1 流動相洗脫條件Table 1 Fluid phase elution conditions

1.2.4 質譜條件的優化

取1 mL 10 mg/L的乙唑螨腈標準工作液，在正離子模式下進行母離子全掃描，得到乙唑螨腈母離子[M]+（m/z394.1）。對母離子施加不同的碰撞能量，對產生的子離子進行全掃描，得到相對豐度較高的乙唑螨腈子離子[M]+（m/z310.1）和[M]+（m/z254.0），質譜條件為離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子源；離子噴霧電壓：3.5 kV；毛細管傳輸溫度：300℃；碰撞壓力：0.199 5 Pa；鞘氣：30 arb；輔氣：10 arb；檢測方式：多反應監測模式（MRM）。具體質譜檢測參數見表2。

表2 乙唑螨腈的多反應離子監測分析參數Table 2 Multi-reactive ion monitoring and analysis parameters of cyetpyrafen

1.2.5 數據處理

所有數據采用Thermo Xcalibur Quan Browser軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線

將乙唑螨腈標準品分別用乙腈溶解并定容，配制成1 000 mg/L的標準儲備溶液，再分別用乙腈稀釋配制成10 mg/L的標準儲備液，于-18℃冰箱中保存備用。為了消除基質效應的影響，使用枸杞空白樣品提取液再分別逐級稀釋為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0 mg/L系列標準溶液。在儀器條件下測定，濃度為0.1 mg/L乙唑螨腈標準溶液色譜圖見圖1，出峰時間在6.30 min。以標準溶液濃度和峰面積作標準曲線，得出乙唑螨腈線性回歸方程、相關系數，結果見圖2。在0.01～1.0 mg/L范圍內，乙唑螨腈的進樣質量濃度（x）與色譜峰面積（y）間線性關系良好，線性方程y=1×107x+115 848，R2=0.999 3，定量限（LOQ）=0.01 mg/kg。

圖1 乙唑螨腈標準溶液（濃度為0.1 mg/L）LC-MS/MS的多反應監測色譜圖Fig.1 Multi-reaction monitoring chromatogram of cyetpyrafen standard solution(0.1 mg/L)using LC-MS/MS

圖2 乙唑螨腈標準曲線Fig.2 Standard curve of cyetpyrafen

2.2 提取溶劑的選擇

提取溶劑應與殘留分析的化合物有良好的溶解性和穩定性，適于樣品制備和色譜分析，不僅要求目標物被充分提取，而且提取的雜質干擾越少越好。根據乙唑螨腈性質，常用的提取劑有乙腈、甲醇和乙醚。在提取溶劑研究中，對比了3種提取溶劑對枸杞鮮、干樣品乙唑螨腈的提取效果，結果見圖3。通過在不同溶劑中的提取率試驗及色譜掃描峰面積與相對標準偏差值的比較結果可知：用甲醇或乙醚提取枸杞樣品中的乙唑螨腈時，回收率均不能達到分析檢測的要求；而采用乙腈提取時，乙唑螨腈的平均回收率均在87.8%～97.3%之間，相對標準偏差（RSD）在5.5%～12.0%之間，完全能滿足分析檢測要求。因此，確定溶解性和穩定性最好的乙腈作為枸杞鮮、干樣品的提取溶劑。同時，試驗還進行了不同提取次數對提取效果的影響研究，結果表明，提取1次與提取2次、3次結果差異不大。從提取效率角度考慮，提取1次完全可以達到較好的效果，最終確定使用乙腈為提取溶劑，提取1次。

圖3 不同提取劑提取效果的研究Fig.3 Research on the extraction performance usingdifferent extractants

2.3 吸附劑的優化

針對目前常用的色譜前處理方法固相萃取（SPE）、QuEChERS法，通過測定乙唑螨腈添加回收率，對各個方法進行篩選。由圖4可見，固相萃取與QuEChERS法效果差異不顯著，從前處理效率考慮，固相萃取較QuEChERS法用時長，從成本考慮，固相萃取較QuEChERS法費用高，綜合后最終確定最佳前處理方法為采用QuEChERS方法處理，用乙腈提取，PSA和GCB凈化。

圖4 不同前處理方法效果的對比Fig.4 Comparisons of the effects of different pretreatment methods

分別考察了不同質量的PSA對凈化效果和回收率的影響。由圖5可見，選用20、50、100 mg PSA，鮮果、干果2種基質中乙唑螨腈的回收率分別為66.2%～86.1%、80.1%～103.0%和63.1%～80.2%。最終選用50 mg PSA加10 mg GCB。鑒于2種基質中乙唑螨腈均滿足農藥殘留檢測的要求，因此未進一步研究基質效應的影響。

圖5 不同質量PSA吸附劑對凈化效果的影響Fig.5 Influence of different weights of PSA adsorbents onpurification effect

2.4 回收率和精密度

在枸杞空白樣品中分別添加3個濃度水平（0.01、0.1、1.0 mg/kg）的乙唑螨腈標準溶液，每個濃度重復5次，按照上述方法對樣品進行測定，結果見表3。枸杞鮮果、干果中乙唑螨腈添加回收率在80.4%～105.6%，RSD在5.5%～12.0%，符合農藥殘留被測組分為0.01～1.0 mg/kg時精密度為18%～22%的要求，該方法高效、快速，具有可行性。乙唑螨腈在枸杞鮮、干果空白及0.1 mg/L添加回收總離子流圖見圖6。

圖6 乙唑螨腈在枸杞鮮、干果上空白及添加色譜圖Fig.6 Chromatograms of fresh and dried Goji berries with and without the addition of cyetpyrafen

表3 枸杞（鮮果、干果）中乙唑螨腈添加回收率、精密度（n=5）Table 3 The recovery rate and accuracy of the addition of cyetpyrafen in Goji berries(fresh fruit,dried fruit)(n=5)

3 結論

本文采用QuEChERS方法處理，乙腈提取，PSA和GCB凈化，建立了枸杞鮮果、干果中乙唑螨腈殘留檢測方法，并對方法的回收率、精密度進行了探討。結果表明，使用該檢測方法乙唑螨腈農藥在枸杞鮮果、干果中平均回收率為80.4%～105.6%，相對標準偏差為5.5%～12.0%，定量限為0.01 mg/kg，方法的精密度和準確性較好，符合農殘分析的要求[22-23]，具有可行性。