ICU常見肺部感染真菌支氣管肺泡灌洗液G、GM實驗診斷價值

沈勇 翁云龍 肖齊俊 李路 張文兵 邵敏

ICU治療中應用糖皮質激素、廣譜抗生素、機械通氣等，均為發生侵襲性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infections， IPFI)的獨立影響因素[1]，致病真菌對抗真菌藥物的敏感性和耐藥性有差異[2]。使用無效抗真菌藥物治療與完全沒有接受治療的患者死亡率相似，且延遲開始抗真菌治療與增加死亡風險相關[3]。IPFI患者能否實現精準抗真菌治療？真菌培養有孵育周期較長、檢出率低、易受污染等缺點，典型CT影像學可作為輔助診斷依據之一，需結合基礎疾病初步診斷[4]，血清真菌成分抗體、抗原PCR、二代基因測序等診斷技術臨床普及尚任重道遠[5]，有研究表明肺泡灌洗液G實驗、GM實驗對IPFI、侵襲性曲霉病早期診斷優于血清，且最佳診斷閾值分別為157 ng/L、1.08 μg/L[6]。故我們探討IPFI真菌分布及各種真菌肺泡灌洗液G實驗、GM實驗診斷價值。

資料和方法

一、研究對象

經安徽醫科大學附屬六安醫院倫理委員會批準(2018LL-ky020)。選取2018年5月～2020年9月期間， 本院ICU和EICU收治的入院時有侵襲性肺部真菌感染(IPFI)高危因素患者96例，按照《重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南(2007)》執行[7]，具體簡要如下：①有至少1項宿主因素，②有肺部感染癥狀，③且具有無菌術下取得的肺組織、胸腔積液、血液、下呼吸道標本組織病理學檢出隱球菌、真菌菌絲、肺孢子菌包囊、滋養體、囊內小體或排除標本污染情況下培養出真菌生長二者之一。患者病情不能耐受纖支鏡檢查或可能短期內死亡、患者或家屬不同意纖支鏡或反復檢測者排除，使用人血白蛋白等血制品、哌拉西林他唑巴坦及磺胺類抗生素、抗腫瘤藥物等可能影響實驗結果的患者需停藥48 h，否則剔除。最終符合納入標準并簽署知情同意書患者中確診IPFI 72例，其中男性42例，女性30例，年齡(59.6±11.6)歲，住院日數(17.9±4.9)日，基礎疾病情況及構成比(見表1)。

表1 IPFI患者基礎疾病分布及構成比

二、方法

1 標本采集 依據患者肺部CT影像學定位感染性病變所在地為目標肺段，在1、3、5日進行肺泡灌洗，留取肺泡灌洗液進行G實驗、GM實驗、真菌培養、離心沉淀后顯微鏡下革蘭染色和墨汁染色顯影法鏡檢，同時抽取靜脈血標本進行血清G實驗、GM實驗、血常規、CRP等檢測。

2 菌株鑒定及分組依據直接鏡檢墨汁染色見圓形厚壁孢子、內有大小不等反光顆粒，尤其是外有肥厚的折光性莢膜，鑒定為隱球菌屬。標本在沙保培養基，37℃溫箱孵育48～72 h，最遲120 h未見真菌菌落生長為陰性。分離鑒定按《全國臨床檢驗操作規程》，假絲酵母菌進行糖發酵實驗、同化實驗對真菌菌落形態進行進一步鑒別。

三、統計方法

結 果

一、真菌分布顯微鏡直接鏡檢出隱球菌5例，肺泡灌洗液真菌培養分離出5種89株真菌，分離率17.87%(95%CI：7.42%～40.23%)，其中白色假絲酵母菌分離率21.30%(95%CI：8.38%～42.15%)、光滑假絲酵母菌分離率16.95%(95%CI：6.53%～37.89%)、熱帶假絲酵母菌分離率12.35%(95%CI：5.45%～31.64%)、克柔假絲酵母菌分離率11.63%(95%CI：4.75%～29.97%)、曲霉菌7.24%(95%CI：3.88%～25.61%)。鑒定前五種主要致病菌屬白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、曲霉菌、光滑假絲酵母菌、隱球菌分別占40.5%、22.47%、12.36%、11.23%、5.62%。詳(見表2)。

表2 IPFI患者感染真菌分布及構成比

二、常見幾種真菌肺部感染患者肺泡灌洗液G實驗、GM實驗各真菌種屬組中，不同菌種屬組間的血清、肺泡灌洗液G實驗水平，以及血清、肺泡灌洗液GM實驗水平差異均有統計學意義(P<0.001)。進一步的SNK-q兩兩比較發現，隱球菌和毛霉菌的血清、肺泡灌洗液G實驗水平低于其他菌種(P均<0.05)，曲霉菌屬的血清、肺泡灌洗液GM實驗水平高于其他菌種(P均<0.05) 。詳見(表3、4)。

表3 不同真菌種屬血清、肺泡灌洗液G實驗水平均值比較

表4 不同真菌種屬血清、肺泡灌洗液GM實驗水平均值比較

三、納入本研究4例淹溺患者中2例痰涂片見酵母樣真菌伴出芽，肺泡灌洗液G實驗升高，GM實驗升高不明顯，培養為白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌各1例，另2例見痰中帶暗紅色出血，肺部CT見多發圓球形稍高密度病灶(詳見附圖1)，同時存在不對稱肢體乏力，顱腦MR見多發圓球形病灶(詳見附圖2)，痰涂片見菌絲，肺泡灌洗液G實驗、GM實驗均升高，尤其GM實驗升高明顯，培養為煙曲霉、黑曲霉各1例。

圖1 肺部曲菌感染CT影像

圖2 腦部曲菌感染MR影像

討 論

白色假絲酵母菌是單細胞真菌，是上呼吸道最常見的定植真菌之一，為條件致病真菌，在一項發展中國家研究發現在機械通氣的第7天，有10%的患者出現血液念珠菌血癥，真菌培養陽性的下呼吸道標本表明，有17%的患者發現了肺部的真菌入侵[13]。長時間使用廣譜抗菌素引起菌群失調感染和機械通氣等原因導致下呼吸道粘膜屏障破壞，同時使用糖皮質激素等免疫抑制劑，使酵母相得以向菌絲相轉變，酵母菌出芽似菌絲伸展附著侵入組織，產生炎癥反應，吞噬細胞介入細胞體液免疫，釋放真菌細胞壁主要組分葡聚糖，故早期肺泡灌洗液G實驗是重要的診斷手段，甚至早于血清G實驗[14]。本研究還發現白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌同種屬不同類真菌感染患者肺泡灌洗液和血清G實驗水平比較差異無統計學意義，若非進行臨床研究和耐藥分析，進一步鑒定菌株的臨床意義不大。

本研究發現IPA患者肺泡灌洗液、血清GM實驗有診斷價值。曲霉菌屬是絲狀真菌，半乳甘露糖是其細胞壁組成成分一種，在免疫功能不全患者，如肺移植后患者的呼吸道中定植曲霉菌在下呼吸道生長較快，菌絲穿透血管，引起血管炎及血管周圍炎，可血栓形成，炎癥細胞參與吞噬、消化并釋放半乳甘露糖。Shahid Husain等[15]研究表明使用支氣管肺泡灌洗培養法和半乳甘露聚糖檢測方法的使用顯著降低了肺移植患者侵襲性曲霉病的延遲治療風險，與常規預防方法相比，抗真菌暴露量降低了50%。

國內外對淹溺并發侵入性肺真菌感染研究和報道較少，本研究有4例淹溺患者納入研究，均系嚴重淹溺，入院時并發急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),同時存在機械通氣、早期使用糖皮質激素情況，且早期抗感染未覆蓋真菌，臨床表現為持續中度發熱，其中2例痰涂片見酵母樣真菌伴出芽，肺泡灌洗液G實驗升高，GM實驗升高不明顯，培養為白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌各1例，可能與有創機械通氣和激素使用，造成上呼吸道定植酵母菌條件下侵入下呼吸道感染；另2例臨床見痰中帶暗紅色出血，肺部CT、顱腦MR見多發感染膿腫病灶，痰涂片見菌絲，肺泡灌洗液G實驗、GM實驗均升高，尤其GM實驗升高明顯，培養為煙曲霉、黑曲霉各1例，符合IPA易侵襲血管引起出血及經血液遠處播散感染的表現，且此2例患者發病時淹溺均吸入非流動污水，符合吸入致病性曲霉菌混合感染的致病機制，肺部影像學與肺泡灌洗液G實驗、GM實驗相結合，有利于IPA的早期診斷。

國外新型隱球菌動物模型研究，從吸入隱球菌真菌顆粒，氣道常駐細胞識別、招募對新型隱球菌的先天免疫、晚期適應性細胞介導的對新型隱球菌的免疫，再到潛伏真菌感染的再激活模型：肉芽腫遏制的分解，提示多發生免疫功能低下人群[16]。本研究發現隱球菌感染患者無論是真菌培養、血清、肺泡灌洗液G實驗、GM實驗檢出率均不高，可能是因為隱球菌是條件致病真菌，在免疫低下患者中感染機率加大，且多為亞急性或慢性深部局限性感染，菌體有厚的莢膜，在非進展成播散感染的嚴重階段，肺泡灌洗液和血清G實驗水平一般較低，與國外隱球菌致病機制研究基本符合。吳歡歡等在25位艾滋病并發肺部隱球菌感染接受測試的患者中，有23位(92.00%)在血清隱球菌莢膜多糖抗原測試中呈陽性[17]，在缺乏對真菌抗原進行檢測的基層醫院，對呼吸道標本的反復墨汁染色鏡檢可能有直接和有利診斷。毛霉菌性肺炎臨床表現無特異性 ,早期呼吸道組織標本病理學證據對于診斷尤為重要[18]。肺部毛霉菌感染患者血清、肺泡灌洗液G實驗、GM實驗水平低下，可能因為例數少代表性差，且毛霉菌為結合菌屬，真菌細胞壁不含葡聚糖和半乳甘露糖，故這種成分檢測實驗無診斷價值。

在侵襲性肺部真菌感染的早期診斷中，對真菌細胞壁成分實驗檢測是一項重要的實驗室診斷技術，但是考慮到感染不同種屬真菌存在微生物學差別以及在感染中病理生理學特點不同，G實驗診斷假絲酵母菌，G實驗聯合GM實驗診斷曲霉菌屬有臨床價值，二者對新隱球菌、毛霉菌診斷價值不大。