利拉魯肽通過circ-sirt1/NF-κB信號通路抑制血管平滑肌細胞炎癥的機制研究

劉 鈺，王 星，崔紅占，孫涌泉，步紀強，陳子英

(河北醫科大學第二醫院心臟大血管外科，河北 石家莊 050000)

血管急性損傷后可通過多種因素引起血管重塑，這一病理過程可導致動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)與經皮腔內血管成形術(percutaneous transluminal angioplasty,PTA)后血管再狹窄等多種心血管疾病的發生[1]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)是構成血管中膜的主要細胞，具有表型轉化的可塑性。研究表明，VSMCs在多種內源或外源性的炎癥因子刺激下，分泌大量細胞黏附因子、趨化因子等，促使VSMCs增殖、遷移，增強動脈粥樣硬化斑塊內炎癥反應，參與內膜新生，最終導致斑塊失穩及最終破裂、管腔狹窄等病理過程的發生[2-6]。胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1，)主要來由回腸的L型內分泌細胞分泌，不僅可以促進胰島β細胞胰島素的分泌，而且能夠顯著抑制α細胞胰高血糖素的分泌，在延遲胃排空的同時抑制餐后血糖升高，發揮顯著的降低血糖的功能，臨床當中用于治療2型糖尿病受到良好的治療效果。利拉魯肽(liraglutide，LIR)是GLP-1類似物，與天然GLP-1高度同源，因其強大的降糖作用和體重減輕而被廣泛用于治療2型糖尿病[7]。最近的研究表明，LIR可顯著降低2型糖尿病患者、非酒精性脂肪性肝病患者血清中的炎性指標水平，并增強抗氧化反應能力，提示LIR可改善患者體內炎癥反應[8-9]。然而，LIR對血管炎癥，尤其是炎癥刺激下VSMCs炎癥反應有何作用目前尚未見到相關的報道。本研究采用LIR對TNF-α誘導的VSMCs進行干預，觀察其對血管炎癥的作用，探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及主要實驗試劑 于河北醫科大學實驗動物中心購買4周齡清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，用貼塊法分離獲得VSMCs。白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)的酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自于中國碧云天公司。Trizol、cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR均購自于美國Invitrogen公司。PCR引物購自于中國上海生工生物工程有限公司。細胞間黏附分子1(inter-cellular adhesion molecule 1,ICAM-1)抗體購自于英國Abcam公司。MCP-1抗體購自于美國Santa公司。GAPDH抗體購自于美國Cell Signaling Technology公司。IκB-α抗體、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB) p65抗體購自于美國Genetex公司。羊抗兔熒光標記二抗購自于中國艾美捷科技有限公司。腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)購自于美國BD公司。利拉魯肽購自丹麥諾和諾德公司。

1.1.2實驗儀器 細胞培養箱購自于Foma Scientific公司。Nanodrop 1000分光光度計、實時熒光定量PCR(ABI7500)均購自于Thermo公司。渦旋震蕩器(Vortex-genie2)購自于Scientific Industries公司。多功能酶標儀購自于Thermo公司。普通PCR儀購、電泳儀、半干式蛋白質印跡轉膜槽、化學發光成像分析儀均購自于Bio-Rad公司。激光共聚焦顯微鏡購自于Leica公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組 4%水合氯醛麻醉后，取胸腹主動脈，用貼塊法分離VSMC，加入含10% FBS的DMEM低糖培養基，置于含有5% CO2的37 ℃恒溫孵箱中培養，待細胞約長滿瓶底80%時，用0.25%的胰酶進行消化傳代，取3～5代細胞用于實驗。實驗分為三組：空白對照NC組，TNF-α組(10 μg/L)和TNF-α+LIR組(10 μg/LTNF-α+ 100 nmol/L LIR)。

1.2.2ELISA檢測培養基促炎因子IL-1β和IL-6變化 將細胞培養24 h后，收集細胞培養基，4 ℃，5 000 r/min離心15 min，吸取等量的上清液體。按ELISA檢測試劑盒說明說進行IL-1β和IL-6檢測。

1.2.3qPCR檢測細胞circ-sirt1、ICAM-1、MCP-1和IκB-α mRNA的變化 收集細胞于無RNA酶離心管中，加入1 mL Trizol，后加入200 μL氯仿，震蕩充分混勻。離心，吸上清，加入新的無RNA酶離心管中加入等量的異丙醇，-20 ℃冰箱靜置30 min。離心，棄上清，加入1 mL 75%乙醇顛倒洗滌。離心，棄上清，吸干殘余液體。晾干數分鐘，加適量DEPC水。使用NanoDrop(ND-1000)檢測其純度及濃度。每組取等量的測定濃度的RNA樣品500 ng～5 μg，按照cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。使用Invitrogen熒光定量試劑盒，按說明書避光配置總體系，體積20 μL，單樣本cDNA及每對引物均需要設置3個復孔，以減少誤差。利用2-△△Ct對目標基因的相對表達量進行分析。

1.2.4Western Blot檢測細胞ICAM-1、MCP-1和IκB-α蛋白表達 將細胞培養24 h后，收集細胞懸液離心，棄上清，加入適量細胞裂解液。冰上裂解30 min，后離心取上清。之后進行蛋白定量，取含等量蛋白細胞裂解液，煮樣。之后進行SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，采用10%的分離膠和5%的濃縮膠。先穩定電壓90 V電泳，待進入分離膠后，換穩定電壓120 V。電泳結束后，半干轉膜20 min。轉膜結束后用含5%脫脂奶粉的TBS液室溫孵育1 h。將封閉后的膜孵育按比例稀釋的一抗，ICAM-1抗體(1∶800)，MCP-1抗體(1∶500)，IκB-α抗體(1∶1 000)，GAPDH抗體(1∶1 000)。4 ℃搖床過夜。洗膜4次，5 min/次。封閉二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。之后再次洗膜4次，孵育發光液，化學發光成像分析儀掃描成像。

1.2.5免疫熒光檢測NF-κB p65蛋白分布 細胞爬片后，給予相應處理，之后加入4%的多聚甲醛固定。室溫PBS緩沖液洗兩次，滴加含0.1% Triton、5%山羊血清的緩沖液PBS打孔封閉。加入適量的緩沖液PBST洗2次。將NF-κB p65抗體(1∶100)按比例用含5%山羊血清的緩沖液PBS稀釋。孵育小片，4 ℃過夜。加入適量的緩沖液PBST，室溫洗3次。避光配置熒光二抗(1∶250)孵育小片，室溫避光結合1 h。在暗室加入適量的緩沖液PBST，室溫洗3次，之后用緩沖液PBS洗1次。在暗室取干凈的載玻片，將小片放置在上，中間滴加適量的DAPI染液，蓋蓋玻片。室溫靜置1 h左右，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。以上實驗均重復3次。

1.3統計學方法 應用Prism 6軟件進行數據分析。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1LIR抑制VSMCs炎性因子的分泌 與NC組相比，在TNF-α刺激下TNF-α組VSMCs培養基中的炎性因子IL-1β和IL-6可顯著升高(P<0.01)。與TNF-α組相比，TNF-α+LIR組VSMCs培養基中的炎性因子IL-1β和IL-6可顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組VSMCs炎性因子的表達 Table 1 The expression of inflammatory factors in VSMCs in each group

2.2LIR促進circ-sirt1的表達 與NC組相比，在TNF-α刺激下TNF-α組VSMCs培養基中circ-sirt1顯著降低(P<0.05)。而與TNF-α組相比，TNF-α+LIR組細胞中circ-sirt1表達顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組circ-sirt1的表達變化Table 2 The expression changes of circ-sirt1 in each group

2.3LIR抑制VSMCs炎癥應答 為進一步探究LIR對VSMCs炎癥應答的作用，qPCR檢測細胞ICAM-1、MCP-1和IκB-α mRNA的變化。與NC組相比，TNF-α組細胞炎癥標志分子ICAM-1和MCP-1 mRNA的表達顯著升高(P<0.01)。與TNF-α組相比，TNF-α+LIR組ICAM-1和MCP-1 mRNA的表達顯著下降(P<0.01)，見表3。以上結果提示，LIR可抑制TNF-α誘導的VSMCs自身炎癥因子的表達。進一步檢測了NF-κB信號通路的抑制因子IκB-α mRNA的表達。與NC組相比，TNF-α組細胞炎癥標志分子IκB-α mRNA的表達顯著降低(P<0.05)。與TNF-α組相比，TNF-α+LIR組IκB-α mRNA的表達顯著上調(P<0.05)，見表4。進一步用Western blot檢測細胞ICAM-1、MCP-1和IκB-α 蛋白的變化，與相應mRNA的變化趨勢一致(圖1)。

表3 各組炎性因子ICAM-1、MCP-1的表達Table 3 The ICAM-1 and MCP-1 expression of inflammatory factors in each group

表4 各組炎性因子IκB-α mRNA的表達Table 4 The IκB-α mRNA expression of inflammatory factors in each group

圖1 各組炎性因子蛋白水平的表達

2.4LIR抑制NF-κB p65的核轉位 NF-κB信號通路激活引起NF-κB p65的核轉位。為進一步證實LIR對TNF-α誘導VSMCs的NF-κB信號通路激活的作用，進行免疫熒光實驗，觀察NF-κB p65的分布。綠色熒光顯示的是NF-κB p65。結果表明(圖2)，NC組細胞中NF-κB p65主要分布在胞漿，而給予TNF-α刺激后，NF-κB p65發生了明顯的核轉位，主要分布在細胞核。與TNF-α組細胞相比，TNF-α+LIR組細胞中NF-κB p65胞漿分布增多，而胞核分布減少。上述結果表明，LIR通過抑制NF-κB p65的核轉位，進而抑制NF-κB信號通路的激活。

圖2 LIR抑制NF-κB p65的核轉位

3 討 論

血管損傷會引起炎癥反應，炎癥反應已被證明在原發性高血壓、動脈粥樣硬化及冠狀動脈術后血管在狹窄等一系列心血管疾病中發揮十分重要的作用[10]。早期引起的炎癥反應可啟動血管修復機制，促進動脈重塑過程，該過程通常伴有血管內膜新生。然而，長期的慢性炎癥反應則可以刺激內膜過度增生，誘導VSMCs由收縮表型向合成型表型轉化，分泌大量炎性介質，同時發生增殖、遷移，參與新生內膜的形成，引起管腔狹窄等[11-13]。有研究表明，異常活化的NF-κB可加重炎癥反應，同時也可以引起免疫應答異常。在糖尿病并發癥的發生發展過程中，NF-κB發揮重要作用[14]。環狀RNA(circular RNA，circRNA)作為一類特殊類型的非編碼RNA，越來越多的研究表明其參與了血管疾病的發生發展。因此，探究如何抑制血管炎癥，以及circRNA在血管炎性疾病中的作用，對于心血管疾病的治療有著至關重要的意義。

近年來，LIR在心血管疾病中的研究越來越多，尤其是在AS和血管損傷后的內膜新生方面。Koshibu等[15]研究發現，LIR對44只鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導的高血糖小鼠具有AMPK依賴性抗動脈粥樣硬化作用，其可能抑制了AMPK依賴的血管內皮細胞促動脈粥樣硬化分子生成的作用。Kushima等[16]在野生型小鼠實驗中發現，LIR治療時劑量依賴性地減少了新生內膜面積。進一步在實驗中發現，LIR劑量依賴性地刺激NO的產生。最后結果表明，在嚴重高血糖的db/db小鼠中，LIR治療也抑制了新生內膜增生，伴血管細胞增殖和密度下降。此外，LIR治療可抑制動脈損傷后7 d的高血糖和血管炎癥。Tsai等[17]研究表明LIR被發現能夠部分通過抑制內皮間質轉化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)抑制糖尿病小鼠的新生內膜形成，進一步明確了LIR的潛在血管新生內膜的治療作用。

上述研究大部分研究目標集中在動物或者內皮細胞中，然而，LIR是否都對作為血管壁細胞主要組成的VSMCs同樣有治療作用？用TNF-α刺激VSMCs構建血管炎癥體外模型，LIR進行干預。首先，檢測了細胞培養基中促炎因子IL-1β和IL-6的表達，發現LIR顯著降低了TNF-α誘導的IL-1β和IL-6的表達，表明LIR能夠減輕VSMCs受炎癥刺激時誘導的局部炎癥反應。ICAM-1是介導細胞間的黏附反應重要因子。正常情況下，在血管內皮細胞中低表達，一旦發生血管損傷，內皮細胞會異常大量表達ICAM-1，高表達的ICAM-1可以介導單核細胞向受損傷的內皮細胞聚集并分化成炎癥巨噬細胞。而在AS的發生發展中，平滑肌細胞也會出現ICAM-1的異常高表達，促進AS病情進展[18]。MCP-1是趨化因子家族成員之一，能夠誘導各種炎癥細胞向炎癥部位募集，是調節單核/巨噬細胞遷移和浸潤的關鍵趨化因子之一[19]。為進一步探究LIR對VSMCs炎癥應答的作用，檢測了炎性標志分子ICAM-1、MCP-1的表達，發現LIR能夠顯著抑制ICAM-1和MCP-1 mRNA和蛋白的表達而抑制炎癥反應。

ICAM-1和MCP-1作為機體炎癥反應的重要標志分子，其表達均受到NF-κB信號通路的調節[20-21]。眾所周知，IκB-α是NF-κB信號通路的天然抑制因子。細胞在未受到刺激的情況下，IκB-α與NF-κB p65、p50三者形成復合物，使得NF-κB p65滯留下胞漿，處于失活的狀態。一旦細胞受到炎癥刺激，IκB-α會發生磷酸化改變，之后進一步進行泛素化降解，NF-κB p65被解離，由失活狀態轉變成活化狀態，其自身的核定位序列暴露，進而發生細胞核轉位，NF-κB 信號通路被激活。因此，進一步檢測了mRNA和蛋白的表達，結果發現LIR能夠顯著減弱TNF-α誘導的IκB-α表達抑制。Kang等[13]研究證實，circ-Sirt1通過序列特異性相互作用抑制NF-κB p65的核易位發揮抗炎作用，因此為證實LIR是否同樣通過上述信號通路夠影響VSMCs進而改善血管炎癥，檢測了circ-sirt1的表達變化，發現LIR可顯著促進TNF-α刺激的VSMCs 中circ-sirt1的表達。免疫熒光進一步證實，LIR能夠顯著抑制TNF-α誘導的NF-κB p65蛋白核易位，提示LIR可能通過促進circ-Sirt1的表達發揮抑制VSMCs炎癥反應作用。

綜上所述，LIR可以抑制VSMCs分泌炎性介質減輕局部炎癥，同時促進circ-sirt1的表達進而抑制細胞NF-κB信號通路的活化，進而抑制血管炎癥。然而，LIR是否在體內也能發揮同樣的作用，有待動物實驗的進一步驗證。