CYP1A1、TSLPR、CCR3在小兒特應性皮炎中的表達及與臨床特征相關性研究

凌琬茗，劉 巖，谷紅霞，趙瑞雪，韓志敏

(河北省兒童醫院皮膚科，河北 石家莊 050031)

特應性皮炎屬于一種慢性、炎癥性、瘙癢性疾病，多發于嬰幼兒期，且此病發病反復，多數患兒可持續至成年期，在臨床上又被稱為遺傳過敏性皮炎、異位性皮炎、特應性濕疹、嬰兒濕疹等，目前此病表現為逐年升高的趨勢，且疾病遷延難愈、劇烈瘙癢在一定程度上影響患兒的正常生長發育[1-2]。研究顯示，近年來我國小兒特應性皮炎的發病率表現為逐年升高的趨勢，部分患兒在臨床治療中并未獲得滿意的效果，具有難以根治的特點，且目前對于小兒特應性皮炎的具體發病機制尚不完全明確，導致患兒疾病反復遷延，給患兒的身心帶來了巨大的痛苦，因此深入分析小兒特應性皮炎的發病機制具有重要的作用[3-4]。本研究深入分析小兒特應性皮炎的發病機制，分析CYP1A1、TSLPR、CCR3在小兒特應性皮炎中的表達，為臨床上此病的診治提供新方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5月—2020年5月我院收治的特應性皮炎患兒89例作為特應性皮炎組，男性42例，女性47例，年齡2.0～8.5歲，平均(4.99±2.83)歲，病程6個月～4.5年，平均(2.12±1.00)年，根據歐洲特應性皮炎評分(Scoring Atopic Dermatitis Index，SCORAD)標準評價患兒疾病嚴重程度，其中得分<25分為輕度(35例)、得分25～50分為中度(39例)、得分>50分為重度(15例)。同期選取行健康體檢的健康兒童80例作為健康組，男性39例，女性41例，年齡2.3～8.6歲，平均(5.18±2.72)歲。兩組納入標準：①特應性皮炎組患兒均符合中華醫學會皮膚性病學分會免疫學組,特應性皮炎協作研究中心所頒布的《中國特應性皮炎診療指南(2020版)》[5]中關于小兒特應性皮炎的診斷標準，②病程≥6個月，③近1周內未接受過疾病相關治療者；④健康組研究對象無皮膚類疾病，近6個月內無感染，身體健康，無家族遺傳史。排除標準：①心、肺、腎等重要臟器功能不全者；②先天性疾病者；③合并其他皮膚病或者感染性疾病者；④近1周內使用過免疫抑制劑、糖皮質激素、抗組胺藥物干預者；⑤皮膚嚴重潰瘍者；⑥精神障礙者。兩組在性別、年齡、居住地等一般資料中比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較Table 1 Comparison of general information in two groups

所有患兒家屬均知情同意本研究，且經醫院倫理委員會審核批準。

1.2方法

1.2.1樣本采集 采集兩組入組后第2天空腹靜脈血3 mL，在密度梯度離心處理下獲得外周血單個核細胞，用于CYP1A1、TSLPR、CCR3測定。

1.2.2CYP1A1、TSLPR檢測方法 采用實時熒光定量PCR測定CYP1A1、TSLPR表達量，取所制備的外周血單個核細胞加入600 μL RNA提取細胞裂解液，充分吹打混合均勻后備用，采用Trizol法提取單個核細胞總RNA，并測定所提取的RNA純度、完整性，當所測得的A260/A280比值在1.8～2.1范圍內、28S寬度為18S的1.5～2.0倍時說明所提取的RNA純度、完整性較好可用于后續指標檢測。采用實時熒光定量PCR法測定外周血單個核細胞中CYP1A1、TSLPR表達量，采用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄獲得cDNA，采用2-△△Ct方法計算CYP1A1、TSLPR表達量。反應體系(27 μL)：上下游引物各1.6 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 10.3 μL;SYB Green 12.5 μL。反應條件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 31 s，共進行40個循環。CYP1A1引物序列：正義鏈：5′-GTCATCTGT-GCCATTTGCTTTG-3′，反義鏈：5′-CAACCACC-TCCCCGAAATTATT-3′；TSLPR引物序列：正義鏈：5′-GCACACTGGCAATGTAATGC-3′，反義鏈：5′-GTTGAACAGAACAAGTGACC-3′；內參基因GAPDH引物序列：正義鏈：5′-AACAGCCTC-AAGATCATCAGCAA-3′，反義鏈：5′-GACTGT-GGTCATGAGTCCTTCCA-3′。

1.2.3CCR3檢測方法 采用熒光抗體標記、流式細胞儀測定外周血單個核細胞中CCR3表達水平，將10 μL CCR3-FITC試劑加入至指標管中，之后在檢測管中加入抗凝血100 μL，并設立同型對照管，振蕩均勻后，在避光室溫下進行孵育，孵育20 min。將2 mL溶血素加入，振蕩均勻后在避光室溫下進行孵育，孵育5 min，之后離心5 min(1 000 r/min)，將上清液棄除后加入2 mL PBS，再次離心5 min(1 000 r/min)，上清液棄除加入300 μL PBS混合均勻，使用美國BectonDickinso公司流式細胞儀檢測CCR3表達水平，使用Cell Quest軟件分別以FSC/SSC給細胞設門，獲取門內10 000個細胞(每管)，分析CCR3表達水平。

1.3統計學方法 應用SPSS 25.0統計軟件分析數據。計量資料比較分別采用t檢驗、F檢驗和SNK-q檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。相關性采用Pearson相關性分析，采用受試者特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析CYP1A1、TSLPR、CCR3對小兒特應性皮炎的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CYP1A1、TSLPR、CCR3在兩組中的表達情況比較 與健康組比較，特應性皮炎組CYP1A1、TSLPR、CCR3表達均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 CYP1A1、TSLPR、CCR3在兩組中的表達情況比較Table 2 Comparison of CYP1A1, TSLPR and CCR3 expressions between two groups

2.2CYP1A1、TSLPR、CCR3與不同臨床特征組間的差異 CYP1A1、TSLPR、CCR3表達在特應性皮炎患兒性別、年齡、伴隨癥狀組間差異無統計學意義(P>0.05)；CYP1A1、TSLPR、CCR3表達不同特應性皮炎患兒疾病嚴重程度、家族過敏史、特應性家族史、個人過敏史相關，與輕度、中度、無家族過敏史、無特應性家族史、無個人過敏史的患兒組間比較，重度、有家族過敏史、有特應性家族史、有個人過敏史的患兒組CYP1A1、TSLPR、CCR3表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同臨床特征組間CYP1A1、TSLPR、CCR3表達的比較Table 3 Comparison of CYP1A1, TSLPR and CCR3 expressions among groups with different clinical characteristics

2.3CYP1A1、TSLPR、CCR3之間相關性分析 Pearson相關性分析顯示，CYP1A1與TSLPR之間呈正相關(r=0.267,P=0.012)；CYP1A1與CCR3之間呈正相關(r=0.359,P=0.001)；TSLPR與CCR3之間呈正相關(r=0.269,P=0.011)。

2.4CYP1A1、TSLPR、CCR3對小兒特應性皮炎的預測價值分析 ROC曲線分析CYP1A1、TSLPR、CCR3對小兒特應性皮炎的預測價值結果顯示，與CYP1A1、TSLPR、CCR3單項預測相比，三項聯合的預測價值較高(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 CYP1A1、TSLPR、CCR3對小兒特應性皮炎的預測價值分析Table 4 Analysis of predictive value of CYP1A1, TSLPR and CCR3 in atopic dermatitis in children

圖1 CYP1A1、TSLPR、CCR3預測小兒特應性皮炎的ROC曲線

3 討 論

小兒特應性皮炎臨床表現較為復雜，在疾病的不同時期其皮損表現不同，較為嚴重的表現為急性濕疹，多伴隨著劇烈瘙癢，目前隨著工業化的不斷發展，小兒特應性皮炎的發病率逐年升高，嚴重影響著患兒的身心和生長發育[6-7]。

細胞色素酶P450屬于一組含有鐵血紅素的超家族，其包含CYP1、CYP2、CYP3三大家族，屬于外源性、內源性物質轉化酶的主要成員，其中CYP1亞家族中的CYP1A1一直是目前所研究的熱點，在一定的刺激下其可與體外的AHR發生特異性結合，使其表達升高，參與多種疾病的發生發展[8-9]。目前隨著臨床上對CYP1A1的不斷深入研究發現，其參與多種生理病理過程，包括氧化應激、免疫反應、急慢性炎癥、動脈粥樣硬化、肺損傷、多種惡性腫瘤、病原體感染等[10-11]。本研究為分析CYP1A1是否與小兒特應性皮炎相關，采集此類患兒外周血單個核細胞，檢測其表達，結果顯示，CYP1A1在此病中表達明顯升高，且與疾病嚴重程度、過敏史、特應性家族史等相關，此結果提示著，CYP1A1可能參與在內源性、外源性的刺激下參與此病，此結果與胡宇晴等[12]在其研究中發現，CYP1A1在特應性皮炎患者中表達升高的結果保持一致。

特應性皮炎皮膚炎癥皮損處的特征表現為活化T細胞浸潤，存在少量的嗜酸粒細胞、肥大細胞、單核細胞、巨噬細胞和大量的CD4+記憶性T細胞，其中CD4+為輔助性Th細胞表面標志物，根據其所執行的功能不同分析三個亞型，即為Th0、Th1、Th2[13-14]。既往研究發現，Th1/Th2細胞失衡在特應性皮炎的發生中具有重要的作用，在疾病處于急性時期時Th1細胞被抑制，而Th2細胞占優勢，TSL受體為Th2型細胞因子，其具有促進此類免疫應答反應的作用[15]。研究表明，TSLP屬于啟動過敏反應的重要因子，TSLPR為其受體，主要在某些T細胞表面、單核細胞、樹突狀細胞上所表達，其主要在樹突狀細胞極化促進Th2型細胞因子產生的過程中發揮著重要的作用[16-17]。另外有研究發現，趨化因子與白細胞募集浸潤炎癥皮損相關，而Th1、Th2細胞表達分化趨化性細胞因子受體，CCR3、CCR4、CCR8主要在Th2細胞上選擇性表達，均為上述細胞的表面標志物[18]。CCR3屬于G蛋白藕聯受體家族成員之一，其主要被CCR3基因所編碼，屬于C-C型趨化因子受體，CCR3可經過與包括CCL11、CCL7、CCL13、CCL5等在內的多種配體產生結合作用發揮其不同的生物效應，其中與CCL11的親和力最強[19-20]。臨床研究顯示，CCR3主要經過與CCL11的特異性結合作用募集并活化嗜酸粒細胞，參與變應性疾病的發生發展[21-22]。本研究結果顯示，TSLPR、CCR3在小兒特應性皮炎中表達明顯升高，且與患兒疾病嚴重程度、過敏史等臨床特征密切相關，此結果提示著TSLPR、CCR3可能在Th1、Th2細胞表達異常的情況下參與此病的發生進展，但本研究并未深入探討其具體作用機制，還需后續研究進一步分析證實，為臨床上此病的早期診斷提供參考。

本研究分析CYP1A1、TSLPR、CCR3三者呈相關性，并采用ROC曲線分析CYP1A1、TSLPR、CCR3對小兒特應性皮炎的預測價值，結果顯示，三者正相關，且與三項單獨預測相比，三項聯合對小兒特應性皮炎的預測價值較高，提示著臨床上可采用三者聯合評估此病，以早期預測，并采取針對性的措施干預，降低發病率，促進患兒疾病恢復。

綜上所述， CYP1A1、TSLPR、CCR3在小兒特應性皮炎中表達升高，且與患兒疾病嚴重程度、家族過敏史、特應性家族史、個人過敏史相關，隨著患兒疾病嚴重程度的增加，表達加劇，且與單項預測相比，三項聯合預測小兒特應性皮炎的價值較高。