齦溝液OPG、IL-35、IL-37在慢性牙周炎中的表達(dá)及與牙槽骨吸收的相關(guān)性

劉曉燕，耿文華，杜莎莎，劉英奇

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院口腔科，河北 邯鄲 056000)

慢性牙周炎是長期存在的牙齦炎逐漸向牙周組織深部擴(kuò)張所致的一種口腔疾病[1]。全國流行病學(xué)調(diào)查顯示，30歲以上群體中約90%患有不同程度牙周疾病，其中以慢性牙周炎最為常見，占比超70%[2-3]。牙槽骨吸收屬牙周炎重要病理變化，正常情況下，牙槽骨吸收與新生維持平衡狀態(tài)，牙槽骨高度恒定，但受牙周炎癥影響，若骨吸收增加和(或)骨新生降低并存時即出現(xiàn)骨喪失致牙齒支持組織喪失，牙齒松動，最終拔除或脫落[4]。近年有關(guān)牙槽骨吸收的治療主要從牙周治療、控制局部炎癥和菌斑等方面入手，但此疾病病機(jī)復(fù)雜，尤其是30歲以上群體，除與局部炎癥、免疫有關(guān)外，還可能與骨流失有關(guān)[5-6]。因此，積極明確牙槽骨吸收相關(guān)生化過程對完善干預(yù)方案至關(guān)重要。核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)是骨形成及吸收耦聯(lián)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而骨保護(hù)素(osteoptegerin，OPG)是RANKL引誘受體，其水平變化可直接影響骨代謝[7]。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-35、IL-37是近年新發(fā)現(xiàn)的與免疫、炎癥有關(guān)白細(xì)胞介素家族成員，其水平變化與多種炎性疾病有關(guān)[8-9]。但慢性牙周炎患者齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平及與牙槽骨吸收間關(guān)系如何鮮見報道，本研究對此探討，旨在為臨床進(jìn)一步探明牙槽骨吸收病理生理機(jī)制提供參考。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月—2021年10月慢性牙周炎患者105例作為試驗組，再選取同期慢性牙周炎患者45例作為驗證組，同期健康體檢者105例為對照組。試驗組男性59例，女性46例，年齡28～69歲，平均(47.98±8.44)歲；體重指數(shù)17～26 ，平均22.06±1.68；慢性牙周炎病程1～7年，平均(3.56±1.08)年；吸煙情況：每日吸煙20例，偶爾吸煙16例，從不吸煙或已戒69例；飲酒情況：過度飲酒19例，適度飲酒34例，從不飲酒或已戒52例。驗證組男性27例，女性18例，年齡26～68歲，平均(48.35±7.22)歲；體重指數(shù)17～26，平均21.89±1.53；慢性牙周炎病程1～8年，平均(3.41±1.03)年；吸煙情況：每日吸煙9例，偶爾吸煙7例，從不吸煙或已戒29例；飲酒情況：過度飲酒9例，適度飲酒13例，從不飲酒或已戒23例。對照組男性63例，女性42例，年齡27～70歲，平均(48.72±7.36)歲；體重指數(shù)17～28，平均21.93±1.41；吸煙情況：每日吸煙22例，偶爾吸煙15例，從不吸煙或已戒68例；飲酒情況：過度飲酒16例，適度飲酒38例，從不飲酒或已戒51例。3組性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙情況、飲酒情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，試驗組和驗證組慢性牙周炎病程差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①試驗組、驗證組符合慢性牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②全口保留牙≥18顆；③無急性牙齦乳頭炎、齦緣炎等其他牙周疾病；④無嚴(yán)重全身系統(tǒng)性疾病；⑤無長期抗生素應(yīng)用史；⑥對照組全身健康；⑦知情本研究內(nèi)容，簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①哺乳及妊娠期女性；②正接受正畸治療者；③入組前3個月內(nèi)有急慢性感染性疾病史。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1齦溝液OPG、IL-35、IL-37檢測 將患牙、牙齦吹干并隔濕，取已備好EP管內(nèi)濾紙條插進(jìn)待測牙近中位牙周袋底，留置60 s，若沾染血則棄除，3 min后再插入1條濾紙條，留置60 s，再3 min插入第3條濾紙條。3濾紙條置入相同EP管稱重，按1 g/L換算體積，EP管內(nèi)加PBS液200 μL，封口，置液氮保存待測。測時取出樣本，室溫解凍，振蕩器振蕩10 min，超聲振蕩1 h，離心10 min(4 ℃，3 000 r/min，半徑8 cm)，收集上清液，采用上海晶抗生物工程有限公司酶聯(lián)免疫試劑盒檢測OPG、IL-35、IL-37水平，嚴(yán)格參照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀在450 nm波長下測樣本光密度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得OPG、IL-35、IL-37水平值。

1.2.2牙槽骨吸收檢測 采用平行投照技術(shù)拍攝數(shù)碼根尖片，拍攝條件為70 kV，12 V，20 mA。拍攝后采用自帶醫(yī)學(xué)影像信息系統(tǒng)的測量工具同一牙位牙槽骨破壞區(qū)域水平向最大距離、垂直向最大距離。

1.3觀察指標(biāo) ①比較試驗組和對照組齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平；②比較試驗組不同臨床特征患者牙槽骨吸收比例；③分析試驗組牙槽骨吸收比例的影響因素，并建立多元線性回歸模型；④組外驗證。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和LSD-t檢驗。采用多元線性回歸模型分析牙槽骨吸收比例的影響因素，并繪制回歸方程評估牙槽骨吸收比例與實際檢測值的散點圖，求出平均絕對偏差(mean absolute deviation，MAD)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1試驗組和對照組齦溝液OPG、IL-35、IL-37比較 試驗組齦溝液OPG、IL-37水平低于對照組，IL-35水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 試驗組和對照組齦溝液OPG、IL-35、IL-37比較Table 1 Comparison of OPG, IL-35 and IL-37 in gingival crevicular fluid of experimental group and control group

2.2試驗組不同臨床特征患者牙槽骨吸收比例比較 105例患者牙槽骨吸收比例為(20.06±6.56)%。不同年齡、病程、牙齒數(shù)量、病情程度、吸煙情況、定期口腔檢查、維生素D缺乏、合并糖尿病、齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平患者牙槽骨吸收比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同性別、體重指數(shù)、飲酒情況、定期洗牙、不良修復(fù)體、偏側(cè)咀嚼、偏好甜食、刷牙頻次、每次刷牙時間、刷牙方式、牙線使用頻次、口腔疾病史、營養(yǎng)不良、維生素C缺乏、合并高血壓、合并高癥血癥、合并骨質(zhì)疏松患者牙槽骨吸收比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 試驗組不同臨床特征患者牙槽骨吸收比例比較Table 2 Comparison of the proportion of alveolar bone resorption in patients with different clinical characteristics of the experimental group

表2 (續(xù))

2.3多元線性回歸分析 以患者牙槽骨吸收比例作為因變量，以表2中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的項目為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示，齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平是牙槽骨吸收比例的影響因素(P<0.05)。建立回歸模型為：牙槽骨吸收比例=6.495-0.180×OPG+0.169×IL-35-0.055×IL-37，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。自變量可解釋牙槽骨吸收比例91.5%的變異量。見表3，4。

表3 變量賦值表Table 3 Variable assignment table

表4 多元線性回歸分析Table 4 Multiple linear regression analysis

表4 (續(xù))

2.4組外驗證 采用驗證組45例患者齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平對回歸模型進(jìn)行驗證，其MAD值為1.25%。見圖1。

圖1 組外驗證散點圖

3 討 論

牙槽骨吸收是在牙周炎長期刺激下造成骨吸收/骨形成平衡偏移而出現(xiàn)的一種病理性改變[11]。慢性牙周炎發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及骨吸收、骨重建及免疫炎癥等多個過程，造成此疾病極易反復(fù)，而進(jìn)一步了解其病理機(jī)制相關(guān)生化信息是指導(dǎo)臨床完善治療方案的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

臨床證實，牙周炎整個病程中牙槽骨吸收與成骨細(xì)胞活力下降、破骨細(xì)胞活力及膠原水解活性增加關(guān)系密切[12]。OPG是腫瘤壞死因子家族主要成員之一，其由成骨細(xì)胞生成并分泌，主要生理作用是通過與RANKL競爭性結(jié)合破骨細(xì)胞表面RANKL受體以抑制破骨細(xì)胞激活[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者齦溝液內(nèi)OPG水平顯著低于健康群體，由此說明慢性牙周炎病情進(jìn)展可能與OPG水平變化有關(guān)。但近年較多研究指出，慢性牙周炎患者牙周狀況是多種因素互相和(或)共同作用的結(jié)果，維生素D缺乏、合并糖尿病、慢性牙周炎病情中/重度等均可能造成或促進(jìn)牙槽骨吸收[15-16]。本研究結(jié)果顯示，不同年齡、病程、牙齒數(shù)量、吸煙情況、維生素D缺乏患者牙槽骨吸收比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與上述研究存在一定異同，同時也說明慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展病機(jī)的復(fù)雜性。此外，OPG低表達(dá)患者牙槽骨吸收更嚴(yán)重(平均值達(dá)21.71%)。分析此機(jī)制可能是：①OPG是成骨細(xì)胞生成的唯一一種破骨細(xì)胞負(fù)向調(diào)節(jié)因子，可作用于破骨細(xì)胞分化末期，抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化及誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡繼而促使骨平衡向骨形成一方偏移[17]。②RANKL是一種骨吸收重要細(xì)胞因子，其在體外可誘使形成破骨細(xì)胞，在體內(nèi)可促使破骨細(xì)胞成熟，而OPG能特異性與RANKL結(jié)合，通過抑制其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成及成熟等過程，促進(jìn)骨形成[18]。因此，當(dāng)慢性牙周炎患者齦溝液OPG低表達(dá)時可能會因骨新生遲緩，而骨吸收活躍最終出現(xiàn)牙槽骨吸收的病理性改變。繼續(xù)多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，齦溝液OPG升高有助于預(yù)防牙槽骨吸收。

另外，齦溝液OPG水平受免疫、炎性多種因素影響[19]，同時研究證實，免疫及炎性改變既是慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展的病理生理特征，又是其發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因子[20]。IL-35、IL-37是近年研究熱點，認(rèn)為二者與多種免疫及感染性疾病有關(guān)[21]。IL-35是Treg分泌的一種炎癥抑制性細(xì)胞因子；IL-37是IL-1家族新成員，但與其他成員不同的是，其既是一種抗炎因子，又兼具免疫抑制作用。有研究表明，牙周組織受微生物感染時齦溝液IL-37水平降低，治療后其水平回升[22]。本研究結(jié)果顯示，慢性牙周炎患者齦溝液IL-37水平降低，IL-35水平升高。但I(xiàn)L-35、IL-37同作為免疫、炎癥相關(guān)因子，表達(dá)趨勢相反的機(jī)制可能是慢性牙周炎大量生成促炎因子時，IL-37作為重要抗炎因子，其被Treg分泌后便與靶細(xì)胞上受體結(jié)合并移位至細(xì)胞質(zhì)，通過調(diào)節(jié)信號通路磷酸激酶激活狀態(tài)而發(fā)揮抗炎作用，造成釋放入齦溝液內(nèi)的水平下降，而IL-35具有獨特的炎性免疫抑制活性，其不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期停滯，阻滯Treg細(xì)胞增殖，同時IL-35與iTreg間存在正反饋調(diào)節(jié)作用，可通過促進(jìn)iTreg分化生成Treg細(xì)胞而大量分泌IL-35。因此，當(dāng)慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展時，齦溝液IL-35、IL-37表達(dá)并不一致。進(jìn)一步建立多元線性回歸模型發(fā)現(xiàn)，齦溝液OPG、IL-35、IL-37是牙槽骨吸收比例的影響因素。但本研究不足之處在于齦溝液取樣本身影響因素很多，生活習(xí)慣、口腔衛(wèi)生、合并基礎(chǔ)疾病等雖然能一定程度上減少混雜因素影響，但仍無法完全，如何進(jìn)一步提高研究準(zhǔn)確性可作為今后研究方向。

綜上所述，慢性牙周炎患者齦溝液OPG、IL-37低表達(dá)及IL-35高表達(dá)均會加劇牙槽骨吸收。