熱處理及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)糖基化燕麥蛋白凝膠性質(zhì)的影響

許英一，馬鑫蕊，王 宇，徐艷霞，林 巍，王 彪，王德香

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

在谷物類食品中，燕麥蛋白質(zhì)含量居首位（11.19%～19.85%）。其蛋白組成中氨基酸均衡且配比合理，其中球蛋白占總蛋白質(zhì)含量的70%～80%，主要由12S、7S和3S蛋白組成，因燕麥蛋白溶解性等功能性質(zhì)較差，限制了其在食品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用。對(duì)蛋白進(jìn)行糖基化、膠凝化等改性處理，將改性蛋白作為添加劑應(yīng)用于食品配方中是一種極具潛力的方法。通過糖基化改性，產(chǎn)物的溶解性、乳化性、凝膠性以及抗氧化活性等功能性質(zhì)均有不同程度的提高。凝膠性質(zhì)是蛋白質(zhì)作為食品添加劑十分重要的功能特性，蛋白質(zhì)凝膠具有黏彈性，可包裹水、脂質(zhì)、風(fēng)味物質(zhì)等食品成分，為新型食品的研發(fā)提供了很好的物質(zhì)基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外對(duì)植物蛋白凝膠機(jī)理的研究主要集中在大豆蛋白上，其他植物蛋白的研究相對(duì)較少。劉建壘研究發(fā)現(xiàn)燕麥蛋白在溫度低于90 ℃時(shí)不能形成凝膠，隨著溫度升高，其破裂力、硬度減小，而黏附性增大。李琳琳以燕麥球蛋白為原料，制備燕麥球蛋白酸性、堿性和中性凝膠，由凝膠的水分弛豫和流變學(xué)特性可知，加熱溫度和球蛋白濃度越高，pH值越小，加熱時(shí)間越長(zhǎng)越有利于燕麥球蛋白凝膠的形成，其凝膠彈性及凝膠網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性越好。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）在參與催化蛋白交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，將酶肽鏈上谷氨酰殘基的γ-酰基，與賴氨酸上的ε-氨基、伯氨基和水發(fā)生交聯(lián)，從而提高蛋白制品破斷力、硬度、持水力等。尚未有采用糖基化分別結(jié)合加熱與TG兩種處理方法進(jìn)行復(fù)合改性燕麥蛋白的凝膠性質(zhì)的報(bào)道。為了將改性蛋白作為添加劑更好地應(yīng)用于食品工業(yè)中，本研究對(duì)燕麥蛋白及其糖基化產(chǎn)物分別進(jìn)行熱處理和TG改性，測(cè)定改性蛋白凝膠的結(jié)構(gòu)和凝膠性質(zhì)，探究糖基化改性結(jié)合熱處理或TG改性對(duì)燕麥蛋白凝膠性質(zhì)的影響。以期為燕麥蛋白的開發(fā)及應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院實(shí)驗(yàn)基地；透析膜（再生纖維素膜，截留分子質(zhì)量1 kDa）生工生物工程（上海）股份有限公司；乳糖 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；TG（酶比活力100 U/g） 江蘇一鳴有限公司；鄰苯二甲醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-amino-1-naphthalene sulfonoc acid，ANS） 上海麥克林生化有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）標(biāo)準(zhǔn)蛋白、辣根過氧化物酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；WK-600A型粉碎機(jī) 上海新諾儀器設(shè)備有限公司；SHA-C型恒溫水浴振蕩器 金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；PC/PLCLD-53型真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Millrock公司；TDL-5A型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DF-11型集熱式磁力加熱攪拌器 山東東易日盛儀器有限公司；PB-10型pH計(jì) 北京賽多利斯儀器有限公司；TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀 北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；Spectrum One型傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；TU-1901型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；EnSpire多功能酶標(biāo)儀 珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳儀北京市六一儀器廠；S-3400N掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麥蛋白及乳糖糖基化產(chǎn)物的制備

1.3.1.1 燕麥蛋白的制備

參考張蓓的方法略作修改。燕麥籽粒磨粉過篩，正己烷脫脂。將脫脂后的燕麥粉以料水比1∶8（g/mL）配制溶液，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為10，在50 ℃水浴振蕩2 h，10 000 r/min離心10 min。將上清液用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.2，靜置30 min，10 000 r/min離心10 min得沉淀。水洗沉淀2 次，調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥，得到燕麥蛋白，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.81%。

1.3.1.2 乳糖糖基化燕麥蛋白（lactose glycosylated oat protein，LGOP）的制備

參考Zhu Dan等的方法略作修改，根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)得到LGOP制備的最優(yōu)工藝為：準(zhǔn)確稱取燕麥蛋白20 g，將其分散于1 000 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 9）中，于35 ℃磁力攪拌1 h使蛋白完全分散。按照乳糖∶蛋白＝2∶1（m/m）加入乳糖，于35 ℃磁力攪拌3 h。置于95 ℃的水浴中加熱反應(yīng)80 min，冰浴冷卻至室溫。4 ℃透析24 h除去未反應(yīng)的乳糖，冷凍干燥后得到LGOP。

1.3.2 燕麥蛋白及LGOP熱誘導(dǎo)凝膠的制備

取25 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的燕麥蛋白及LGOP溶液置于50 mL小燒杯內(nèi)，調(diào)節(jié)至一定pH值。磁力攪拌1 h，在某一溫度下水浴加熱一定時(shí)間后，冰浴急速冷卻至室溫。取出置于4 ℃冰箱中下靜置過夜（12 h），分別得到燕麥蛋白熱誘導(dǎo)凝膠（heat induced gel of oat protein，HIGOP）和LGOP熱誘導(dǎo)凝膠（heat induced gel of LGOP，HIGLGOP），測(cè)定其凝膠強(qiáng)度。

1.3.3 HIGOP制備的最優(yōu)工藝

根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)，得到HIGOP制備的最優(yōu)工藝：蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%；pH 10；反應(yīng)溫度100 ℃；反應(yīng)時(shí)間2.5 h。

1.3.4 HIGLGOP制備的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為考察因素，以凝膠強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用4因素3水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化HIGLGOP制備工藝條件。

1.3.5 燕麥蛋白及LGOP TG誘導(dǎo)凝膠的制備

取25 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的燕麥蛋白及LGOP溶液置于50 mL小燒杯內(nèi)，磁力攪拌1 h使蛋白質(zhì)充分溶解，調(diào)節(jié)至一定pH值。加入一定量TG，在某一溫度水浴振蕩一定時(shí)間后，90 ℃下使酶滅活10 min，冰浴急速冷卻至室溫。取出置于4 ℃冰箱中靜置過夜（12 h），分別得到燕麥蛋白酶誘導(dǎo)凝膠（oat protease induced gel，OPIG）和LGOP酶誘導(dǎo)凝膠（lactose glycosylated oat protease induced gel，LGOPIG），測(cè)定其凝膠強(qiáng)度。

1.3.6 OPIG制備的最優(yōu)工藝

根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)，得到OPIG制備的最優(yōu)工藝：蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%；酶添加量50 U/g；pH 7；反應(yīng)溫度55 ℃；反應(yīng)時(shí)間3 h。

1.3.7 LGOPIG制備的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶添加量、pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為考察因素，以凝膠強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用5因素4水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化LGOPIG制備的工藝條件。

1.3.8 質(zhì)構(gòu)性質(zhì)測(cè)定

參考Zhang Qi等方法并進(jìn)行改動(dòng)。將4 種燕麥蛋白凝膠樣品分別切割成圓柱形（35 mm×30 mm）放置于25 ℃平衡30 min。采用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)地剖面分析，測(cè)定其彈性、硬度和膠黏性。蛋白凝膠強(qiáng)度定義為穿透凝膠所需的最大破斷力（g）。參數(shù)設(shè)置：測(cè)前速率5.0 mm/s；測(cè)試速率5.0 mm/s；測(cè)試后速率5.0 mm/s；觸發(fā)力0.2 N；穿透距離10 mm；壓縮比50%。

1.3.9 持水性測(cè)定

采用離心法，分別取2.0 g 4 種燕麥蛋白凝膠樣品置于離心管中，于4 ℃、10 000×g離心15 min。記錄離心前離心管總質(zhì)量（m）、離心后離心管總質(zhì)量（m）及空離心管質(zhì)量（m），計(jì)算凝膠持水性：

1.3.10 表面疏水性（H）測(cè)定

采用ANS熒光探針法并進(jìn)行改動(dòng)。用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7）分別將4 種燕麥蛋白凝膠樣品配制質(zhì)量濃度為0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL的燕麥蛋白凝膠，加入20 μL 8 mmol/L ANS熒光探針，漩渦混合。室溫下避光反應(yīng)15 min，在激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，狹縫5 nm的條件下測(cè)定蛋白與ANS結(jié)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度，以燕麥蛋白凝膠濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，線性回歸曲線的初始斜率即為H0。

1.3.11 SDS-PAGE測(cè)定

根據(jù)馮芳等的方法，略有改動(dòng)。采用15%分離膠、5%濃縮膠進(jìn)行垂直夾板電泳。用碳酸鹽緩沖溶液（0.02 mol/L、pH 7）配制燕麥蛋白凝膠的質(zhì)量濃度為2 mg/mL，上樣量10 μL。樣品在分離膠時(shí)恒壓80 V，樣品在濃縮膠時(shí)恒壓120 V，當(dāng)指示劑前沿距電泳槽膠底0.5 cm時(shí)，關(guān)閉電源停止電泳。取下凝膠后分別用考馬斯亮藍(lán)R-250和Schiff試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)和糖蛋白染色。

1.3.12 熒光光譜測(cè)定

用0.01 mol/L pH 7.6磷酸鹽緩沖溶液配制質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的燕麥蛋白凝膠樣品，采用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行內(nèi)源熒光光譜分析。為降低酪氨酸殘基干擾，激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，掃描發(fā)射光譜范圍為300～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.13 FTIR測(cè)定

分別稱取2 mg的燕麥蛋白凝膠樣品，加入0.2 g溴化鉀，研磨均勻，壓成均一透明的薄片。用FTIR儀測(cè)定波數(shù)為4 000～400 cm的紅外光譜，分辨率4 cm，波數(shù)精度0.01 cm，掃描次數(shù)32 次，環(huán)境溫度25 ℃。

1.3.14 微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

分別將4 種燕麥蛋白凝膠切成方形并冷凍干燥。參考賈子璇等的方法，樣品經(jīng)噴金處理后，用SEM測(cè)定其微觀結(jié)構(gòu)，電壓10 kV，4 種燕麥蛋白凝膠的放大倍數(shù)分別為HIGOP 10 000 倍、HIGLGOP 10 000 倍、OPIG 200 倍、LGOPIG 10 000 倍。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 HIGLGOP的工藝優(yōu)化分析

由表1可知，各因素對(duì)HIGLGOP凝膠強(qiáng)度的影響大小為：蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值＞反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)溫度。由表2可知，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值對(duì)HIGLGOP凝膠強(qiáng)度的影響顯著（P＜0.05），而反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)凝膠強(qiáng)度無顯著影響。結(jié)合表1和表3得到最優(yōu)組合為ABCD，即蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、pH 10、反應(yīng)時(shí)間2 h、反應(yīng)溫度95 ℃，通過最優(yōu)組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到HIGLGOP凝膠強(qiáng)度為（186.13±1.97）g，高于表1中9 個(gè)正交試驗(yàn)的結(jié)果。后續(xù)實(shí)驗(yàn)在此最優(yōu)條件組合下進(jìn)行。

表1 HIGLGOP制備條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and results for optimization of preparation conditions of HIGLGOP

表2 HIGLGOP制備條件的方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance for the effect of four variables on gel strength of HIGLGOP

表3 HIGLGOP制備條件的4因素多重比較結(jié)果Table 3 Multiple comparison of four variables

2.2 LGOPIG的工藝優(yōu)化分析

由表4可知，各因素對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響大小為：酶添加量＞蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值＞反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)溫度。由表5可知，酶添加量對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響顯著（P＜0.05），而蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)其無顯著影響；結(jié)合表4和表6得到最優(yōu)組合為ABCDE，即蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、酶添加量40 U/g、pH 6.5、反應(yīng)時(shí)間2.0 h、反應(yīng)溫度55 ℃，通過最優(yōu)組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到凝膠強(qiáng)度為（159.64±1.83） g，高于表4中16 個(gè)正交試驗(yàn)的結(jié)果。后續(xù)實(shí)驗(yàn)在最優(yōu)組合下進(jìn)行。

表4 LGOPIG制備條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Orthogonal design and results for the optimization of preparation conditions of LGOPIG

表5 LGOPIG制備條件的方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance results for the effect of five variables on gel strength of LGOPIG

2.3 燕麥蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)性質(zhì)分析

由圖1可以看出，與HIGOP相比，其他3 種燕麥蛋白凝膠的彈性和硬度均顯著提高（P＜0.05）；4 種燕麥蛋白凝膠中，LGOPIG的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)最好。與HIGOP相比，LGOPIG的彈性、硬度和膠黏性分別提高了7.27%、9.49%和13.01%。LGOPIG的彈性和膠黏性顯著高于HIGLGOP（P＜0.05）；LGOPIG的質(zhì)構(gòu)特性顯著高于OPIG（P＜0.05）。這與杜洪振等的研究結(jié)果一致。添加TG可以提高蛋白凝膠的彈性、硬度和膠黏性，這可能是由于蛋白帶凈電荷，加入TG后與蛋白發(fā)生交聯(lián)，降低了蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力。此外，在加熱過程中蛋白質(zhì)內(nèi)部的非極性多肽會(huì)暴露出來，從而增強(qiáng)了臨近多肽非極性片段的疏水相互作用，進(jìn)而形成結(jié)構(gòu)更加致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)。糖基化蛋白由于引入許多親水羥基，易形成分子間氫鍵，因此更易形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠，其凝膠的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)提高。

表6 LGOPIG制備條件的5因素多重比較結(jié)果Table 6 Multiple comparison of five variables for the preparation of LGOPIG

圖1 4 種燕麥蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)Fig. 1 Texture properties of four oat protein gels

2.4 燕麥蛋白凝膠持水性分析

由圖2可以看出，4 種燕麥蛋白凝膠中，LGOPIG的持水性最好。與HIGOP相比，其他3 種燕麥蛋白凝膠的持水性都顯著提高（P＜0.05），HIGLGOP、OPIG、LGOPIG的持水性分別提高了14.21%、4.86%、22.22%。兩種酶誘導(dǎo)蛋白凝膠（OPIG、LGOPIG）的持水性分別高于兩種熱誘導(dǎo)蛋白凝膠（HIGOP、HIGLGOP）；兩種糖基化改性蛋白凝膠（HIGLGOP、LGOPIG）的持水性分別高于兩種未糖基化改性蛋白凝膠（HIGOP、OPIG）。這可能是由于肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基和賴氨酸殘基的ε-氨基分別作為酰基的供體和受體，使燕麥蛋白形成分子內(nèi)及分子間的ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸異肽鍵，使蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，形成更多水的結(jié)合位點(diǎn)，留住更多的水分，從而使得TG改性后燕麥蛋白的持水性顯著提高，這與于殿宇等的研究結(jié)果一致。葛俠研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白糖基化后形成的凝膠強(qiáng)度和持水性明顯高于沒有糖基化處理的樣品，這與本研究結(jié)果一致，這是由于親水性糖基的導(dǎo)入能夠提高蛋白質(zhì)的持水能力。

圖2 4 種燕麥蛋白凝膠的持水性Fig. 2 Water-holding capacity of four oat protein gels

2.5 燕麥蛋白凝膠表面疏水性分析

由圖3可以看出，兩種酶誘導(dǎo)蛋白凝膠（OPIG、LGOPIG）的H分別高于兩種熱誘導(dǎo)蛋白凝膠（HIGOP、HIGLGOP）；兩種糖基化改性蛋白凝膠（HIGLGOP、LGOPIG）的H分別低于兩種未糖基化改性蛋白凝膠（HIGOP、OPIG）。有可能是H由蛋白質(zhì)的表面殘基暴露的程度所決定。暴露于分子表面的疏水性殘基越多，H越強(qiáng)。燕麥蛋白經(jīng)TG催化后，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，多肽鏈展開，疏水區(qū)域從分子內(nèi)部基團(tuán)暴露出來，使H升高，這與臧學(xué)麗等的結(jié)論一致。糖基化改性蛋白凝膠的H低于未糖基化改性蛋白凝膠，表明糖基化會(huì)阻礙熱處理過程中蛋白質(zhì)的變性，從而減少疏水殘基的暴露，這與趙城彬等的研究結(jié)果一致。

圖3 4 種燕麥蛋白凝膠的表面疏水性Fig. 3 Surface hydrophobicity of four oat protein gels

2.6 燕麥蛋白凝膠的SDS-PAGE分析

由圖4可以看出，與熱誘導(dǎo)蛋白凝膠（HIGOP、HIGLGOP）相比，TG交聯(lián)后的蛋白凝膠（OPIG、LGOPIG）在分離膠頂端有大量大分子質(zhì)量的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，且其31.0、21.0 kDa處的顏色相對(duì)熱誘導(dǎo)蛋白凝膠明顯變淺，同時(shí)還有大分子質(zhì)量的蛋白堆積在槽內(nèi)無法向下遷移，不能進(jìn)入凝膠（箭頭處）。結(jié)果表明，TG引起燕麥蛋白發(fā)生分子間或分子內(nèi)交聯(lián)而形成大分子質(zhì)量的交聯(lián)產(chǎn)物，這和Zhao Qiang等的研究結(jié)果一致。因此，TG可促進(jìn)燕麥蛋白發(fā)生分子內(nèi)或者分子間的交聯(lián)，形成大分子質(zhì)量的聚合物。全越研究了TG對(duì)燕麥麩皮球蛋白的結(jié)構(gòu)修飾，得出酶促糖基化球蛋白的亞基帶比糖交聯(lián)球蛋白明顯，這直接證實(shí)TG催化氨基糖連接到球蛋白分子中。

圖4 4 種燕麥蛋白凝膠的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE patterns of four oat protein gels

2.7 燕麥蛋白凝膠熒光光譜分析

由圖5可知，兩種酶誘導(dǎo)蛋白凝膠（OPIG、LGOPIG）的熒光強(qiáng)度分別高于兩種熱誘導(dǎo)蛋白凝膠（HIGOP、HIGLGOP）；兩種糖基化改性蛋白凝膠（HIGLGOP、LGOPIG）的熒光強(qiáng)度分別高于兩種未糖基化改性蛋白凝膠（HIGOP、OPIG）。HIGOP、HIGLGOP、OPIG、LGOPIG的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別為358、355、349、353 nm，說明TG交聯(lián)后的蛋白最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)減小，發(fā)生了藍(lán)移。酶誘導(dǎo)蛋白凝膠的熒光強(qiáng)度高于熱誘導(dǎo)凝膠，原因?yàn)門G使得燕麥蛋白交聯(lián)，引起蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，色氨酸、酪氨酸等發(fā)色氨基酸暴露，引起熒光強(qiáng)度增大。這與丁欣悅的研究結(jié)果一致。糖基化改性蛋白凝膠的熒光強(qiáng)度高于未糖基化改性蛋白凝膠是因?yàn)楹辛u基結(jié)構(gòu)的糖與蛋白進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，使整個(gè)體系的親水性增強(qiáng)，改性后的樣品在水相中更容易分散，進(jìn)而提高蛋白的熒光強(qiáng)度。朱小燕采用TG分別對(duì)米渣蛋白和糖基化后的米渣蛋白進(jìn)行交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后的蛋白熒光強(qiáng)度有明顯上升，且最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)同樣發(fā)生了藍(lán)移的現(xiàn)象。

圖5 4 種燕麥蛋白凝膠的熒光光譜圖Fig. 5 Fluorescence spectra of four oat protein gels

2.8 燕麥蛋白凝膠的FTIR分析

如圖6所示，與未糖基化改性燕麥蛋白凝膠（HIGOP、OPIG）相比，糖基化蛋白凝膠（HIGLGOP、LGOPIG）在3 200～3 700 cm范圍內(nèi)吸收峰變寬，證明燕麥蛋白與乳糖共價(jià)結(jié)合之后，復(fù)合物的羥基數(shù)量增加，引起C—OH的伸縮振動(dòng)。在酰胺I帶區(qū)域（1 600～1 700 cm）中，吸收導(dǎo)致C＝O鍵的拉伸振動(dòng)，因此被認(rèn)為是用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化最敏感的區(qū)域。由圖6可知，經(jīng)TG改性處理后的蛋白，其波形均向高波數(shù)偏移約1～2 cm。這說明在TG影響下，蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，氫鍵作用變?nèi)酰沟肅＝O化學(xué)鍵的鍵長(zhǎng)減小，而化學(xué)鍵的伸縮振動(dòng)與鍵長(zhǎng)的平方根呈反比，由于鍵長(zhǎng)減小使伸縮振動(dòng)頻率增加，因此導(dǎo)致波數(shù)增加。Wang Pei等通過FTIR測(cè)定分析得出，酶的添加改變了蛋白質(zhì)之間的相互作用，形成更穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)。

圖6 4 種燕麥蛋白凝膠的FTIR光譜圖Fig. 6 FTIR spectra of four oat protein gels

2.9 燕麥蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

圖7 4 種燕麥蛋白凝膠的SEM圖Fig. 7 SEM images of four oat protein gels

從圖7可以看出，與未糖基化的燕麥蛋白凝膠（圖7A和C）相比，LGOP凝膠（圖7B和D）的表面結(jié)構(gòu)變得更加疏松和多孔。這可能是糖基化反應(yīng)形成了不均勻結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致燕麥蛋白凝膠的功能性質(zhì)發(fā)生變化。與未經(jīng)TG交聯(lián)的燕麥蛋白（圖7A和B）相比，經(jīng)TG交聯(lián)的燕麥蛋白凝膠（圖7C和D）中的蛋白大小發(fā)生了很大的變化且凝膠空間中孔徑減少。這說明TG能夠降低蛋白質(zhì)分子間的無序聚集形成更加有序的結(jié)構(gòu)。Han Minyi等研究表明，TG誘導(dǎo)使得豬肉肌原蛋白凝膠中的小塊狀結(jié)構(gòu)減少，大塊狀結(jié)構(gòu)逐漸增多，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。王逢秋節(jié)等研究表明，由于TG的加入，MgCl-TG豆腐的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較鹽鹵冷榨豆粉豆腐得到了明顯的改善，包裹更多的冷榨豆粉纖維顆粒，將隨機(jī)聚集的凝膠網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞B續(xù)性的蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使其更為致密。

3 結(jié) 論

采用熱處理及TG處理對(duì)燕麥蛋白及其糖基化產(chǎn)物進(jìn)行膠凝化改性，TG處理的蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)、持水性、H均高于熱處理蛋白凝膠，糖基化改性燕麥蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)、持水性均高于未糖基化改性的燕麥蛋白凝膠，而糖基化改性燕麥蛋白凝膠的H低于未糖基化改性的燕麥蛋白凝膠。結(jié)果說明TG與蛋白發(fā)生交聯(lián)降低了蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，易形成結(jié)構(gòu)致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，提高了蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)性、持水性及H；連接了許多親水羥基的糖基化蛋白易形成分子間氫鍵，提高了蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)性、持水性，降低了蛋白凝膠的H。

通過SDS-PAGE、熒光光譜、FTIR光譜和SEM分析，證明TG能夠改變蛋白質(zhì)之間的相互作用，形成更穩(wěn)固的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)，且凝膠微觀結(jié)構(gòu)更加均勻致密。因此，可以認(rèn)為TG預(yù)處理比熱處理能夠有效地改善燕麥蛋白凝膠的性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)，可以為改善燕麥蛋白凝膠的性質(zhì)及其在食品工業(yè)的應(yīng)用提供新思路。